Notch 의존적 전사 조절에 미치는 Akt의 영향

Abstract

Notch 신호 전달은 세포의 발생, 분열, 그리고 세포 사멸에 영향을 줄 뿐 아니라 기관 형성이나 형태 형성에 전반적인 영향을 주며, 동물의 발생에서 세포의 운명을 결정짓는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (Artavanis-Tsakonas et al., 1999). 또한 정상 세포의 암화 그리고 세포의 신혈관 형성에도 관여한다고 알려져 최근까지 활발한 연구가 진행되고 있다 (Bolos et al., 2007; Takeshita et al., 2006). 세린-스레오닌 인산화효소 Akt는 PI3K의 중요한 실행기로서, PI3K 활성에 반응하여 효소, 전사 인자 외에도 다른 조절 분자들의 활성을 조절하고 인산화시킨다. 이러한 Akt 신호 전달은 세포 분열, 생존, 증식, 포도당 대사와 혈관 형성 들을 조절한다고 알려져 있다 (Testa et al., 2005). 본 연구에서는 Akt가 Notch 의존적 전사에 미치는 영향을 조사하였다. 293T와 Cos7 세포주를 이용한 실험 결과 미리스틸화된 활성 Akt가 Notch 의존적 전사를 저해시켰으며, 돌연변이 유발를 통해 인산화효소 활성을 없앤 우성음성 Akt (dnAkt ― Akt1 K179M, Akt2 K180A, Akt3 K177M)는 Notch 의존적 전사 활성능을 저해시키지 못했다. 히스톤 탈아세틸화 효소인 HDAC1과 우성음성 HDAC1 (H141A) 그리고 HDAC 저해제 TSA를 이용한 실험에서 Akt에 의한 Notch 의존적 전사 조절 기작이 HDAC1을 경유해 일어나지 않는다는 것을 확인하였다. 또한 Flag으로 표지된 CBF1과 보조억제인자 SMRT를 이용하여 상호면역침전법을 수행한 결과, CBF1과 SMRT의 결합이 Akt에 영향을 주지 않는 것을 확인하여 Akt에 의한 Notch 전사 활성능의 저해가 보조억제인자 SMRT에 의한 기작이 아님을 확인하였다. Myc으로 표지된 Notch 세포 내 영역 (NICD)의 세포 내 위치를 확인해본 결과 Akt를 함께 형질주입한 세포에서 핵 안에 위치해야 하는 NICD 단백질의 위치에 변화가 관찰되었다. 한편, Akt 의존적 인산화 부위인 RXRXXS/T 부분을 인지하는 Akt 기질 항체를 사용한 western blot 결과 NICD의 전사 능력 조절은 Akt에 의한 인산화 의존적으로 일어날 가능성이 제시되었다.; We have investigated the effect of Akt/PKB on Notch intracellular domain (NICD)-mediated transcription. The transient transfection studies using both 293T and Cos7 cells revealed that myristylated constitutive active Akt could down-regulate NICD-dependent transcription in both cell lines. Studies using kinase-dead dominant negative Akt (dnAkt - Akt1 K179M, Akt2 K180A, and Akt3 K177M) showed that Akt kinase activity is responsible for down-regulation of NICD-dependent transcription in all three different reporter constructs (4XCSL, HES-Luc, 6XNRE). Studies using histone deacetylase, HDAC1, dominant negative HDAC1(H141A) and TSA revealed that regulation of Notch-dependent transcription is not mediated by HDAC1 dependent mechanism. Co-immunoprecipitation studies with Flag-CBF1 and SMRT showed that Akt could not affect the association between CBF1 and SMRT, suggesting that recruitment of SMRT is not the mechanism responsible for Akt-mediated downregulation of Notch-dependent transcription. When the intracellular localization of myc-tagged NICD was investigated, all three Akt isoforms effectively inhibited proper nuclear localization of NICD. Futhermore, dnAkt isoforms could not efficiently inhibit nuclear localization of NICD, suggesting that kinase activity of Akt is responsible for mislocalization of NICD in the perinuclear cytoplasm. Studies using Akt substrate antibody which recognizes peptides and proteins containing RXRXXS/T motif phosphorylated by Akt, showed that there is an increase in the phosphorylation of NICD by Akt coexpression. Taken together, these results may suggest possible regulation of NICD transcription activity by Akt-mediated phosphorylation and subsequent inhibition of proper nuclear localization of NICD.