Dunaliella 종의 cDNA chip 분석을 통한 염도와 열 스트레스 조건에서의 유전자 발현 연구

Abstract

다양한 환경적 스트레스 (빛, 염도, 열) 조건에서 Dunaliella sp. 의 분자적 반응을 조사하기 위하여 전사 단계를 microarray분석방법을 통하여 조사하였다. 고광도의 스트레스를 받은 Dunaliella sp. 의 cDNA library로부터 778개의 발현유전자 단편(ESTs) 데이터베이스가 구축되고, 이를 이용하여 저염도(0.08M NaCl)와 고염도(4.5M NaCl), 열 스트레스(42℃)를 받은 Dunaliella sp. 를 이용하여 cDNA chip을 제작하였다. Microarray 분석에서 총 778개의 ESTs 중 염도 스트레스 하에서 발현 변화를 보인 유전자는 164개였고 이 중 47개의 유전자는 저염도 스트레스를 받았을 때 발현이 증가하였으며 55개 유전자는 고염도 스트레스에서 발현이 감소하였다. 저염도 스트레스 하에서 발현변화는 고염도 스트레스에서의 유전자의 48%만이 발현량이 변화하였다. 그러나 Venn diagram분석을 통하여 두 염도 스트레스 사이에서 발현변화를 보이는 유전자들의 밀접한 관계가 관찰되었으며 스트레스에 의하여 특이적으로 유도되는 64개의 유전자들을 찾아내었다. 열 스트레스를 받은 세포에서는 77개의 유전자가 발현 변화를 보였으며 이들 중 25개의 유전자는 발현량이 증가하였으나 52개의 유전자는 발현이 감소하였다. 모든 염도와 열 스트레스 하에서 공통적으로 발현량이 증가한 유전자는 HSP와 SAP가 있었으며 이들 유전자는 스트레스 하에서 일반적으로 유도되는 유전자로 보인다. Microarray 결과를 확인하기 위하여 정량 real-time RT PCR 을 수행 하여 각 유전자들의 발현 양상이 유사하게 나타나는 결과를 얻었다. 이로써 cDNA microarray 분석결과의 높은 정확성을 입증할 수 있었다.; To investigate the molecular responses to varieties of environmental stress such as light, salt and heat, a survey of the Dunaliella sp. transcriptome was performed by microarray analysis. 778 expressed sequence tags (ESTs) were generated from a cDNA library of irradiance-stressed Dunaliella sp. and were prepared and fabricated for the cDNA microarray. Microarrays of the Dunaliella sp. were performed under salt (0.08 M and 4.5 M NaCl) and heat (42℃) stressed culture conditions. The microarray analysis indicated that 164 out of those 778 ESTs changed their expression levels in response to different salinity climate conditions, and there are 77 genes exhibiting differential expression under heat (42℃) stress conditions. Among the changed genes, 164 show more than a two-fold change compared to the control condition (1.5M NaCl), the expression of 42 genes was increased after low salinity stress and the expression of 55 genes was suppressed after high salinity treatments. One-hundred thirty-three genes have been revealed to show up- and down-regulation by high salinity (4.5M NaCl). Of the high salinity-regulated genes 48% were also influenced by low salinity (0.08M NaCl), revealing a dense overlap between low and high salt responses. Only 31 genes are regulated independently by low salt condition. Strong relationships, however, were observed in the expression of these extreme salinity-responsive genes based on Venn diagram analysis, which found 64 stress-inducible genes that responded to these two salinity conditions. Out of the 77 genes expressed in the heat (42℃) stress condition, 25 genes were up-regulated and 52 genes were down-regulated. Up-regulated genes under all salinity and heat stress conditions are heat shock protein and synapyl alcohol dehydrogenase which one though to the universal to stress-inducible genes. For validation of the microarray results, quantitative, real-time PCR analyses were employed. We confirmed that the differentially expressed genes showed high correlations between the two methods.