반복적인 허혈양상화가 흰쥐의 앞정강근과 가자미근에서 산화질소합성효소 발현에 미치는 영향

Abstract

허혈양상화는 짧은 허혈과 재관류를 반복하는 과정으로 역치 이상의 허혈자극이 있을 때 세포를 보호하는 것으로 알려져 있다. 허혈과 재관류가 일어나는 동안 산화질소가 생성되어 여러 종류의 전사인자들을 활성화시키고, 활성화된 전사인자들은 세포보호 단백질이나 세포자멸사를 유도하는 단백질들을 발현시킨다. 산화질소합성효소(nitiric oxide synthase, NOS)는 산화질소의 생성에 필요한 효소로 3종류의 산화질소합성효소(nNOS, iNOS, eNOS)가 알려져 있으며, 3종류의 NOS 이형들은 허혈손상에 영향을 준다고 알려져 있다. 이에 본 연구자는 허혈양상화가 산화질소합성효소의 발현에 미치는 영향을 흰쥐의 백색근육과 적색근육섬유에서 비교 관찰하고자 본 실험을 실시하였다. 9주령의 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐를 대조군과 실험군으로 나누었고, 실험군은 허혈양상화 횟수에 따라 3회, 6회, 10회군으로 나누었으며, 허혈양상화 후 재관류 시간에 따라 0시간, 3시간, 6시간, 24시간, 72시간군으로 세분하였다. 허혈양상화는 흰쥐의 온엉덩동맥을 5분 허혈과 5분 재관류를 반복하여 실시하였고, 재관류 시간에 따라 실험동물을 희생시켜 앞정강근과 가자미근을 적출하였다. 근육의 먼쪽부분은 파라핀절편은 만들어 neuronal NOS (nNOS), inducible NOS (iNOS), endothelial NOS (eNOS)의 면역조직화학염색을 시행하였고, 몸쪽부분은 Western blot analysis를 시행하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 허혈양상화는 nNOS를 대조군보다 증가시켰다. 앞정강근에서 nNOS의 증가는 허혈양상화 3회군과 6회군에서 컸고, 가자미근에서는 허혈양상화 횟수에 따른 nNOS의 차이가 크지 않았다. 2. 허혈양상화는 iNOS를 대조군보다 증가시키며, iNOS의 증가는 가자미근보다 앞정강근에서 더 크게 관찰되었다. iNOS는 허혈양상화 10회군이 가장 크게 관찰되었다. 3. 허혈양상화는 eNOS를 대조군보다 증가시키며, eNOS의 증가는 재관류 0시간과 3시간, 6시간에 앞정강근보다 가자미근에서 더 크게 관찰되었다. 재관류 0시간과 3시간에 eNOS는 허혈양상화 6회군과 10회군에서 크게 관찰되었으나, 24시간 이후에는 큰 차이가 없었다. 이상의 실험결과에서, 허혈양상화 횟수의 증가는 허혈손상을 유도하는 것으로 알려진 iNOS를 증가시키고, iNOS의 증가폭이 크게 관찰된 앞정강근이 가자미근보다 허혈자극에 민감할 것으로 생각되었다.; Ischemic preconditioning (IP), a short period of ischemia followed by a brief period of reperfusion, is known to provide protection from a subsequent much longer ischemic insult. Niric oxide (NO) generated during ishemic-reperfusion phase, activates various transcriptional factors induced the expressions of cytoprotective proteins or pro-apoptotic proteins. Nitric oxide synthase (NOS) catalyzes the conversion of L-arginine to NO and L-citrulline. There are three known NOS: nNOS, iNOS and eNOS, and all three isoforms play a role in ischemic-reperfusion injury. The purpose of this study was to observe the expression patterns of nNOS, iNOS and eNOS in the rat tibialis anterior and soleus muscles after multiple cyclic episodes of ischemic preconditioning. Nine weeks old male Sprague-Dawley rats were divided into control and IP groups. The IP group was further divided into 3 groups based on cycle of IP. For IP, left commom iliac artery was occluded 3, 6 and 10 times for 5 minutes ischemia followed by 5 minutes reperfusion using rodent vascular clamps. The animals were sacrificed at 0, 3, 6, 24 and 72 hours of reperfusion and the left tibialis anterior and soleus muscles were removed. The proximal portions of muscles were frozen in liquid nitrogen, and the distal portions of them were made in paraffin-sections. The expression of nNOS, iNOS and eNOS were examined with immunohistochemical methods and Western blot analysis. The results were as follows; 1. IP increased the expression of nNOS, compared with the control group. In the tibialis anterior muscle, the levels of nNOS in the 3IP and 6IP groups were higher than that in 10IP group, but in soleus muscle, the level of nNOS showed no difference among the IP groups. 2. IP increased the expression of iNOS, compared with the control group, and the levels of iNOS in tibialis anterior muscle were higher than that in soleus muscle. The level of iNOS in the 10IP group was higher than those in the 3IP and 6IP groups. 3. IP increased the expression of eNOS, compared with the control group, and at 0, 3 and 6 hours after reperfusion, the level of eNOS in soleus muscle were higher than that in tibialis anterior muscle. At 0 and 3 hours after reperfusion, the level of eNOS in 6IP and 10IP groups were higer than that in 3IP groups, and at 24 hours after reperfusion, the level of eNOS showed no differences with increasing episode of IP. In summary, these results suggest that the IP increases the expression of nNOS, iNOS and eNOS, and 10 times of IP increases the expression iNOS induced ischemic injury. Also, the increases of iNOS in tibialis anterior muscle is higher, compared with soleus muscle, tibialis anterior muscle is more susceptabile to ischemic injury than soleus muscle.