인간 배아줄기세포의 초기 분화 계통 결정에 관한 연구

Abstract

인간 배아줄기세포는 배반포의 내부세포덩어리로부터 유래한 세포로, 체내 발생 과정에서 내부세포덩어리에서 내배엽판(epiblast)과 외배엽판(hypoblast, primitive endoderm)으로 분화, 발달하는 것으로 알려져 있다. 내배엽판는 삼배엽으로 발달하고 외배엽판은 난황낭(yolk sac)으로 발달하며, 난황낭은 혈도(blood island)로부터 최초의 혈구세포(blood cell)을 생산한다. 인간 배아줄기세포는 미분화 유지 배양 과정 중에도 착상된 배아와 유사한 발달과정을 거치는 것으로 알려져 있으며 이에 따라 자연분화 세포들이 출현한다. 본 연구에서는 자연분화 세포의 분화특성을 확인하고자 연구를 진행하였다. 미분화 세포와 자연분화된 세포들을 미세조작 계대법으로 각각 분리하여 동일한 조건에서 배양 한 후 미분화세포와 자연분화 세포의 분화특성을 비교 분석하였다. 자연분화군은 계대 횟수가 진행될수록 유전자와 단백질 발현 수준에서 전분화능 표지인자인 Oct4, Nanog 발현은 감소하여 분화가 진행 중인 것을 확인하였다. 자연분화 세포의 Lineage commitment를 확인하고자 삼배엽 표지인자의 발현을 확인하였다. 외배엽 표지인자인 MAP2, Neuro D1는 발현하지 않았으나 내배엽과 중배엽 표지인자는 계대가 증가할수록 발현이 증가하였으며 특히, 혈관모세포의 표지인자 KDR과 조혈모 유전자 CD34가 현저하게 증가하였다. 외배엽판 세포의 표지인자로 알려진 GATA6, GATA4, FOXA2 발현이 증가함을 알 수 있었고 면역 세포 화학 염색 시 Oct4, E-cadherin 발현이 감소하는 자연분화된 세포에서는 GATA6 발현이 증가하는 것에 근거하여 자연분화된 세포는 외배엽판을 구성하는 세포라는 결론을 얻었다. 즉, 인간 배아줄기세포로부터 출현하는 자연분화 세포 중에 외배엽판 유사 세포가 존재한다는 것은 배아의 난황낭 발달과정을 모방하고 있는 것으로 판단하며, 인간 배아줄기세포가 인간 초기발생 연구모델로서 유용함을 제시하는 것이다.; Human embryonic stem cells are derived from inner cell mass of blastocysts. Inner cell mass gives rise to epiblast and hypoblast(primitive endoderm) in gastrula stage. Then the three germ layers of the embryo proper are formed solely from the epiblast and hypoblast form portion of the external membranes, especially the yolk sac. The yolk sac produces the first blood cells from the blood islands. In the culture of hESCs, spontaneously differentiated cell population emerged from undifferentiated hESCs. We performed to confirm the characterization of spontaneously differentiated cell populations from undiffernetiated hESCs. These cell populations were separated from each portion of hESCs through a micro-dissecting transfer technique. The cells were cultivated at undifferentiated human embryonc stem cells culture conditions and then the characterization of each cell population was analyzed, respectively. During subculture, differentiated cell populations were shown that the expression of Oct4 and Nanog, pluripotency markers, was decreased and did not detect MAP2 and Neuro D1. While, endoderm and mesoderm gene expression level was increased. Especially, increasing expression of KDR (hemangioblast marker) and CD34 (hematopoietic gene) were detected by RT-PCR. Genes representative of hypoblast cells, GATA6, GATA4 and Foxa2 were indeed detectable by RT-PCR and Western blot. Also, in immunostaining results, differentiated cell population to be decreased Oct4 expression, at the same time increased GATA6 expression. Therefore, we confirmed that spontaneously differentiated human embryonic stem cells might be hypoblast cells, which are differentiated into yolk sac. We expect that may be enlarged of differentiating ratio into hematopoietic lineages.