생쥐의 배아, 핵이식 및 처녀생식 줄기세포주에서 각인 유전자 Snrpn, H19, Igf2r 의 메틸화 현상에 대한 연구

Abstract

생쥐 배아 줄기세포 (mouse embryonic stem cells) 는 개체 내 모든 세포 (cell) 로 분화 가능한 전 분화능 (pluripotency) 을 갖고 있으며, 배반포 (blastocysts) 의 세포괴 (inner cell mass: ICM) 로 부터 만들어 지는 것으로 알려져 있다. 배아 (embryo)의 발생 (development) 과 분화 (differentiation) 는 유전자 발현의 조절에 의해서 정밀하게 조절되며, 특히 DNA 메틸화 (methylation) 는 중요한 유전자 발현 조절기작 중 하나이다. 생식세포의 수정과 분화 과정에서 전체 유전체의 뚜렷한 메틸화 변화가 일어나며, 이러한 변화는 배아의 정상 발생과 분화에 있어서 매우 중요하고, 마찬가지로 줄기세포에서의 DNA 메틸화 현상도 발생과 분화에 중요한 영향을 미칠 것으로 생각된다. 본 연구는 각 줄기세포주에서 각인 유전자의 메틸화 양상에 대하여 연구하였다. 생쥐로부터 각각 수정란 줄기세포 (fertilized-ES cells), 활성화된 난자로 만들어진 처녀생식 줄기세포 (parthenogenetic-ES cells) 그리고 체세포인 구세포 (cumulus cell) 을 이용한 핵 이식 난자로 만들어진 체세포 핵 이식 줄기세포 (nuclear transfer-ES cells) 를 확립하였고, DNA 메틸화 특성 중 특히 부모의 기원에 따라서 특징적인 메틸화 양상을 보이는 각인 유전자 small nuclear ribonucleoprotein N (Snrpn), H19 fetal liver mRNA (H19), insulin-like growth factor 2 receptor (Igf2r)의 메틸화 양상을 확립된 줄기세포주에서 확인하였다. 모든 확립된 줄기세포주들의 미분화 특성을 확인하기 위해서 알칼리성 인산가수분해효소 염색법 (alkaline phosphatase staining) 으로 줄기세포주의 활성을 확인하고, 면역조직 화학법 (immunohistochemstry) 에 의해서 줄기세포 표면에 특이적으로 발현하는 전사인자인 Oct3/4와 SSEA-1 (stage-specific embryonic antigen 1)의 발현을 확인하였으며, 미분화 상태의 줄기세포에서 특이적으로 발현하는 Oct4와 Nanog의 발현을 확인함으로써 확립된 세포주들 모두 줄기세포 특성을 지녔으며, 미분화 상태임을 확인하였다. 그리고 유전체 (genomic) DNA marker인 D1MIT362, D7MIT44와 DXMIT136 과 미토콘드리아 (mitochondrial) DNA markers인 A9348G과 C9461T 를 중합효소 연쇄반응을 이용하여, 각 줄기세포주의 종을 확인하였다. 각 줄기세포에서 각인 유전자 H19, Igf2r 와 Snrpn의 DNA 메틸화 양상을 확인하기 위해서 유전체 DNA를 추출하여 bisulfite 처리 후에 메틸화 현상이 나타나는 부위를 중합효소 연쇄반응으로 증폭 후 직접 염기 서열 분석 (sequencing) 방법으로 확인하였다. 그 결과 H19 유전자에서 총 16개의 CpGs 부분을 관찰하였고 그 중에서 수정란 줄기세포주는 전체 CpGs 부분 중에서 15개의 CpGs 부분이 리 메틸화 (de novo methylation) 현상이 나타난 반면에 처녀생식 줄기세포와 체세포 핵 이식 줄기세포주는 모든 CpGs 부분에서 반 메틸화 (semi-methylation) 현상을 확인하였다. 그리고 확인한 부분에서 총 8개의 CpGs 부분이 있는 Igf2r 유전자는, 모든 줄기세포주에서 6개의 특정 CpGs 부분에서 모두 리 메틸화 현상을 확인 할 수 있었다. 마지막으로 Snrpn 유전자는 총 16개의 CpGs 부분에 메틸화 현상을 확인하여, 수정란과 체세포 핵 이식 줄기세포주에서 반 메틸화 현상을 관찰할 수 있었지만 처녀생식 줄기세포주 2번, 7번과 8번은 전체 리 메틸화 되고, 특히 모든 처녀생식 줄기세포주에서 4개의 특정 CpGs 부분이 리 메틸화되는 것을 확인하였다. 이러한 현상은 모든 처녀생식 줄기세포주에서 리 메틸화 현상이 진행되고 있다는 것을 의미한다. 결론적으로 수정란 줄기세포주에서 각인 유전자의 리 메틸화 현상이 확인되며, 처녀생식 줄기세포주와 체세포 핵 이식 줄기세포주에서 역시 점진적인 리 메틸화 현상을 확인하였다. 결국 모든 줄기세포주의 메틸화 양상은 수정과 난자 활성화 이후에 리 프로그래밍 (reprogramming) 이 이루어져 비 메틸화 되고 배반포 시기를 거쳐 줄기세포 시기에서 대부분 리 메틸화 현상이 관찰된다는 것을 확인하였다.; Mouse embryonic stem (mES) cells have ability to self-renewal and to differentiate into all cell types of the organism. mES cells are derived from the inner cell mass (ICM) of blastocysts. Early development and differentiation of embryo was delicately regulated by gene expression. Especially, DNA methylation is one of the important mechanisms of the regulation of gene expression. During fertilization and early development, methylation pattern of whole genome in germ cells is dramatically changed. And this change is a crucial for normal development and differentiation of the embryos. The regulation of the DNA methylation is thought to be critical for normal differentiation in stem cells as well. In this study, two fertilized, six parthenogenetic, and one nuclear transferred (NT) stem cell lines were established from fertilized embryo, parthenogenetically activated after sham nucleation procedure, and substitution of oocytes nuclei by cumulus cell nuclei, respectively. DNA methylation patterns, especially for imprinting genes - small nuclear ribonucleoprotein N (Snrpn), insulin-like growth factor 2 receptor (Igf2r) and H19 fetal liver mRNA (H19) . which show different methylation patterns depending on the parent of origin, were analyzed in established stem cell lines. All established cell lines were characterized as undifferentiated ES-like cells by alkaline phosphatase staining, immunohistochemstry of stem cell markers Oct3/4 and SSEA-1 and RT-PCR of the Oct4 and Nanog. And also, several genomic microsatellite markers such as D1MIT362, D7MIT44, and DXMIT136, and SNPs of mitochondrial DNA markers, A9348G and C9461T were analyzed for identification of parthenogenetic and NT stem cell lines. The methylation patterns of Snrpn, Igf2r and H19, in each cell lines are examined by PCR after bisulfite treatment of genomic DNA and direct sequencing methods. Out of 16 CpG sites in the H19 gene, 15 CpG sites showed de novo methylation pattern at in fertilized ES cell lines, On the other hand, all CpG sites showed semi-methylation pattern in parthenogenetic and NT stem cell lines. There are 8 CpG sites in the PCR products for Igf2r gene, and all CpG sites showed de novo methylation pattern site in all stem cell lines. Lastly 16 CpG sites were examined in the Snrpn gene. All CpG sites in fertilized and NT stem cell lines showed semi-methylation patterns. On the other hand, de novo methylation pattern at the all CpG sites was shown in parthenogenetic stem cell lies 2, 7 and 8. Particularly, the same 4 CpG sites were methylated in all parthenogenetic stem cell lines, which mean de novo methylation is in proceeding in all parthenogenetic stem cell lines. In conclusion, all fertilized ES cell lines showed de novo methylation pattern. And CpG sites of the genes in parthenogenetic and NT stem cell lines became progressively de novo methylation. The methylation patterns were reprogrammed to demethylated by fertilization and oocyte activation and then in most, de novo methylation is occurring blastocysts and stem cell stages.