Physicochemical and Physiological Characteristics of Enzymatically Modified-Rice Starch

Abstract

본 연구는 기능성 탄수화믈 소재로서의 용도 개발과 식품에의 응용 및 생리활성 증진을 목적으로 한국인의 식생활 패턴에서 섭취 비중이 가장 높은 쌀 전분을 이용하여 효소처리 정도에 따른 지소화성 전분과 난소화성 전분의 형성 조건을 조사하여 최적화함과 동시에 지소화성과 난소화성 전분의 구조- 식품-생리학적 연관성을 확립하기 위하여 수행되었다. 1) 효소(pullulanase) 처리 정도를 달리한 쌀 전분을 제조한 후 이화학적 특성 및 소화율 변화를 측정하였으며, 2) 반응표면분석법(RSM)을 이용하여 지소화성 전분과 난소화성 전분의 최적 형성조건을 확립하였고, 이화학적, 형태학적 특성 및 소화율 변화를 생전분과 비교, 분석하였다. 또한, 3) 지소화성 전분과 난소화성 전분의 생체 내에서의 생리활성의 변화를 알아보기 위하여 동물 실험을 이용하여 체중, 체지방 형성 및 지질 대사에 미치는 영향을 조사하였다. 1. 쌀 전분에 효소(pullulanase)를 전분 건량의 0.5-20.0% (w/v) 첨가한 후 8, 12, 24시간 동안 가수분해 하여 효소 처리 정도를 달리한 쌀 전분을 제조한 후 이화학적 특성 및 소화율을 측정하였으며, 결과는 다음과 같다. 총당을 이용하여 가수분해 정도를 측정한 결과 효소첨가량(0.5-20.0%, db)에 따라 0.90 → 7.98% (8 hr), 1.00 → 9.49% (12 hr), 1.46 → 10.29% (24 hr)로 증가하였으며, 일차식 그래프를 그려 기울기와 R2값 (correlation coefficient)을 비교하여 상관관계를 알아본 결과 각각 R2= 0.99, 0.98과 0.94로 높게 나타났다. 중합도는 효소첨가량(0.5-20.0%, db)에 따라 29.45 → 5.20 (8 hr), 17.03 → 3.88 (12 hr), 5.93 → 3.68 (24 hr)로 감소하였다. 아밀로오스 함량은 8시간과 12시간 가수분해 한 경우 0.5-10.0%까지는 증가하다가 20.0%에서 감소하였으며, 24시간의 경우에는 효소첨가량에 따른 차이를 보이지 않았다. Starch fraction (RDS, SDS, and RS)함량은 효소첨가량에 따라 급소화전분(RDS)은 78.31 → 63.20% (8 hr), 76.28 → 53.11% (12 hr), 60.22 → 44.65% (24 hr)로 감소하였고, 지소화전분(SDS)은 0.89 → 5.55% (8 hr), 3.34 → 12.46% (12 hr), 13.44 → 22.18% (24 hr)로, 난소화전분(RS)은 20.79 → 31.25 (8 hr), 20.38 → 34.43% (12 hr), 26.34 → 32.09% (24 hr)로 유의적으로 증가하였다 (p<0.05). In vitro 전분 분해율(ISVD)은 효소첨가량이 증가할수록 모든 가수분해 시간에서 감소하였으며, 그 값은 다음과 같다: 332.1 → 275.4 mg maltose/g (8hr), 324.1 → 255.4 mg maltose/g (12hr), 320.6 → 173.9 mg maltose/g (24hr). Blue dextran을 이용하여 측정한 팽윤력(Swelling factor, SF), 흡수율(Water absorption index, WAI)과 용해도(Water solubility index, WSI) 모두 모든 가수분해 시간에서 효소첨가량이 증가할수록 유의적으로 감소하였다(p<0.05). 냉-해동 사이클을 반복하여 측정한 이수율(syneresis)은 모든 가수분해 시간에서 효소첨가량이 증가할수록 유의적으로 감소하였으며(p<0.05), turbidity를 측정하여 retrogradation 정도를 알아본 결과 효소첨가량에 따라 1.48 → 2.69(8 hr), 1.86 → 2.71(12 hr), 2.47 → 2.78(24 hr)로 증가하였다. 신속점도계(RVA, Rapid Visco Analyzer)를 이용하여 호화 패턴을 측정한 결과 peak viscosity, breakdown과 setback 모두 모든 가수분해 시간에서 효소첨가량에 따라 유의적으로 감소하였다(p<0.05). X-ray 측정 결과 효소처리 전분은 amylose-ethanol complex 혹은 amylose-lipid complex 형성과 기존의 pattern 변화 및 새로운 peak의 생성 (2θ=20°)으로 인한 결정 구조의 변화를 관찰할 수 있었다. 2. 지소화성 전분과 난소화성 전분의 최적 형성 조건을 알아보기 위하여 50-950 μL의 효소(pullulanase) 농도(X1), 5-85°C(X2)의 저장온도 및 1-5회의 autoclaving cycle(X3)을 독립변수로 하고 지소화성 전분(Y1)과 난소화성 전분(Y2) 수율을 반응변수로 하여 반응표면분석을 수행하였으며, 소화율 정량은 GOPOD 법을 이용하였다. 지소화성 전분(Y1)에 대한 회귀식은 Y1 = 31.07** - 3.68X1** - 3.02 X1X2** + 3.23 X2X3*- 4.71X12** - 2.66X22**으로 산출되었고 최적 제조 조건은 효소 농도가 482 μL, 저장 온도가 36°C, 3회의 가열-냉각일 때 32.28%의 생성율이 예측되었으며 실측값은 29.17%로 나타났다. 난소화성 전분(Y2)에 대한 회귀식은 Y2 = 29.20** + 4.30X1** + 3.27X2* + 2.88X3*으로 산출되었고 최적 제조 조건은 효소 농도가 610 μL, 저장 온도가 63°C, 3회의 가열-냉각일 때 35.00%의 생성율이 예측되었으며 실측값은 33.24%로 나타났다. 반응표면분석의 독립변수들에 의한 반응변수들의 영향을 관찰한 결과, 지소화성 전분(Y1)은 효소 농도 및 효소 농도와 저장 온도의 상호작용에 의해, 난소화성 전분(Y2)은 효소 농도에 의해 가장 크게 영향 받는 것으로 확인되었다. 최적 생성 조건에서 지소화 및 난소화성 전분을 제조한 후 이화학적, 형태학적 특성 및 소화율 변화를 생전분과 비교, 분석하였으며 결과는 다음과 같다. 아밀로오스 함량은 지소화 전분과 난소화 전분이 각각 24.97%, 30.13%로 생전분(21.26%)에 비해 유의적으로 높게 나타났으며, particle size analyzer로 측정된 평균 입자크기는 지소화 및 난소화전분은 각각 134.55 μm, 153.23 μm로 9.67 μm의 생전분 보다 크게 증가하였다. Blue dextran을 이용하여 측정한 팽윤력(Swelling factor, SF)은 생전분이 13.22, 지소화 및 난소화 전분이 각각 9.79와 7.51로 나타났다. 용해도(Water solubility index)는 1.05%의 생전분에 비해 지소화 (17.3%) 및 난소화 (13.10%) 전분이 유의적으로 증가하였으며(p<0.05), 흡수율(Water absorption index)은 생전분은 4.02, 지소화와 난소화 전분이 각각 3.94, 2.41로 나타났다. 흡유율(Oil binding capacity)은 지소화 및 난소화 전분이 각각 1.40 g of oil/g, 1.24 g of oil/g로 나타나 생전분(1.61 g of oil/g)보다 유의적으로 감소하였다(p<0.05). 이수율(syneresis)을 측정한 결과 생전분이 42.82%, 지소화 및 난소화 전분이 각각 74.51%, 76.33%로 유의적으로 증가하였으나(p<0.05), 두 전분 사이에는 차이가 거의 없었으며, 640 nm에서 72시간 동안 측정한 탁도(turbidity) 역시 생전분에 비해 두 전분 모두 저장 기간 동안 빠르게 증가하였으나 두 전분 사이에는 커다란 차이를 보이지 않았다. 소화효소(α- amylase)에 의한 가수분해율은 지소화 및 난소화 전분이 각각 53.21%, 44.80%로 생전분(12.95%) 보다 크게 증가하였지만 대조구(67.84%) 보다는 소화율이 감소하였다. RVA 분석 결과 지소화 및 난소화 전분 모두 pasting curve가 발견되지 않았다. Scanning electron microscopy (SEM)를 이용하여 표면을 측정한 결과 지소화 및 난소화 전분의 제조 과정으로 인해 전분 입자의 붕괴 및 다공성 망상구조를 보였으며, 높은 결정성을 띠는 부분은 수평으로 층이 져 패킹되어 있는 것을 알 수 있었다. 3. 지소화성 전분과 난소화성 전분의 최적 형성 조건을 알아보기 위하여 50-950 μL의 효소(pullulanase) 농도(X1), 5-85°C(X2)의 저장온도 및 1-5회의 autoclaving cycle(X3)을 독립변수로 하고 지소화성 전분(Y1)과 난소화성 전분(Y2) 수율을 반응변수로 하여 반응표면분석을 수행하였으며, 소화율 정량은 DNS 법을 이용하였다. 지소화성 전분(Y1)에 대한 회귀식은 Y1 = 25.73** + 1.83X3* - 2.55X12** - 2.91X22**으로 산출되었고 최적 제조 조건은 효소 농도가 498 μL, 저장 온도가 47°C, 5회의 가열-냉각일 때 29.13%의 생성율이 예측되었으며 실측값은 26.94%로 나타났다. 난소화성 전분(Y2)에 대한 회귀식은 Y2 = 29.13** + 1.42X1** + 2.27X2** + 1.15X3* - 1.74X22** - 1.38X32**으로 산출되었고 최적 제조 조건은 효소 농도가 838 μL, 저장 온도가 62°C, 3회의 가열-냉각일 때 32.64%의 생성율이 예측되었으며 실측값은 30.11%로 나타났다. 반응표면분석의 독립변수들에 의한 반응변수들의 영향을 관찰한 결과, 지소화성 전분(Y1)은 효소 농도와 저장 온도에 의해 가장 큰 영향을 받는 것으로, 난소화성 전분(Y2)은 효소 농도와 저장온도 및 가열-냉각 횟수 모두에 의해 영향을 받는 것으로 나타났다. 최적화에서 제조된 지소화성 전분과 난소화성 전분의 체중감소 및 지질저하 효과를 고지방식이를 섭취시킨 동물 모델을 이용하여 조사하였다. 실험용 마우스 (C57BL/6 mice)를 5그룹 (정상식이군, 고지방식이군, 쌀전분, 지소화전분, 난소화전분)으로 구분하고, 6주 동안 자유로이 섭취하게 하였다. 식이섭취량은 고지방식이군과 지소화 및 난소화전분 간에 차이가 없었고, 식이효율은 지소화 전분과 난소화 전분에서 유의적으로 감소하였다(p<0.05). 체중은 고지방식이군에 비해 쌀전분, 지소화 및 난소화 전분군에서 유의적이지는 않으나 감소하는 경향이었으며, 신장지방 무게는 세 군 모두 고지방식이군에 비해 유의적으로 감소하였다(p<0.05). 혈장 지방, 중성지질, 총 콜레스테롤 및 LDL-콜레스테롤은 쌀 전분과 난소화전분 첨가군에서 유의적으로 감소하였으며(p<0.05), 간 지질은 지소화 전분에서, 간의 콜레스테롤은 난소화 전분에서 유의적으로 감소하였다(p<0.05). 분변의 지질농도, 중성지방 및 콜레스테롤 농도는 지소화 전분에서, 담즙산 배설은 난소화 전분에서 유의적으로 증가하였다(p<0.05).; The objectives of this study were 1) to investigate the effect of enzymatic treatment (pullulanase concentration and hydrolysis time) on physicochemical properties of modified rice starch, 2) to evaluate the effects of enzymatic modification on the rate and extent of starch digestion, 3) to determine and compare the ratio of the major starch fractions [rapidly digestible starch (RDS), slowly digestible starch (SDS), and resistant starch (RS)] using different analytical in vitro methods (GOPOD vs. DNS method), and 4) to investigate the optimal conditions for producing SDS and RS and compare physicochemical properties and physiological functions of optimized SDS and RS. Rice starch was treated with different concentrations of enzyme and hydrolysis times. As hydrolysis time and enzyme concentration increased, the fraction of RDS decreased (78.31→44.65%), whereas SDS (0.8 →22.18%) and RS (20.79→34.43%) increased. As enzyme concentration increased, in vitro starch digestibility (ISVD) decreased in all hydrolysis time. Swelling factor (SF), water absorption index (WAI), and water solubility index (WSI) significantly decreased, while syneresis and turbidity increased as the concentration of enzyme increased in all hydrolysis time. Pasting properties of enzyme-treated rice starch decreased with increasing amount of pullulanase, regardless of hydrolysis time. The X-ray diffraction of enzyme-treated rice starch showed A-type and a weak V-type pattern. Optimum conditions for production of SDS and RS were determined by response surface methodology (RSM) and determination of starch fraction (RDS, SDS, and RS) was evaluated using GOPOD and DNS method. Also, physicochemical properties and response in mice of optimized SDS and RS were investigated in comparison with native rice starch. Using GOPOD method, the optimum conditions for SDS fraction were obtained at the [pullulanse concetration, X1] of 482 μL, [storage temperature, X2] of 36°C, and [A-C cycle, X3] of 3, and for RS fraction, were determined to be 610 μL (X1), 63°C (X2), and cycle of 3 (X3). Amylose content of SDS and RS significantly increased in comparison to native rice starch (p<0.05). For SDS and RS fractions, WAI was increased, SF, WAI, and oil binding were decreased compared to native rice starch. During the freeze-thaw cycles, the native rice starch gel showed significantly lower syneresis than did SDS and RS gels. The turbidity values of SDS and RS fraction were higher than native rice starch. The extent of hydrolysis with α-amylse followed the order: cooked (67.84%) > SDS (53.21%) > RS (44.80%) > Native rice starch (12.94%). Pasting curves of SDS and RS were flat and paste viscosity showed a drastic reduction. The granule morphology of SDS and RS showed disrupted granular form, and bigger, irregularly shaped particles as compared to native rice starch. Using DNS method, the optimum conditions for SDS fraction were obtained at the [pullulanse concentration, X1] of 498 μL, [storage temperature, X2] of 47°C, and [A-C cycle, X3] of 5, and for RS fraction, were determined to be 838 μL (X1), 62°C (X2), and cycle of 3 (X3). The body weight gain did not differ among the groups. In rice treatment groups (Rice-Native, Rice-SDS, and Rice-RS) perirenal fat weight significantly decreased compared to the high-fat control group (p<0.05). Rice-RS and Rice-Native groups significantly lower serum lipid and cholesterol concentrations (p<0.05). The serum triglyceride levels were significantly lower in mice fed Rice-SDS and Rice-RS groups (p<0.05). The total liver cholesterol decreased significantly in rice treatment groups (Rice-Native, Rice-SDS, and Rice-RS) (p<0.05). The total liver cholesterol lowering effect was observed in Rice-RS group. The total lipid content and triglyceride in fecal significantly increased in Rice-SDS group (p<0.05). The total fecal cholesterol in mice fed both Rice-SDS and Rice-RS were significantly higher than in all other groups (p<0.05). Fecal bile acid excretion in mice fed Rice-RS was significantly higher than that in mice fed Rice-Native an Rice-SDS (p<0.05).