사람 Adenylate kinase isozyme 1의 P-loop 부위의 serine^(19)에 대한 부위지정변이에 의한 구조-활성상관 연구

Abstract

Adenylte kinase(AK)는 모든 세포에 존재하는 에너지대사에 관련하는 효소로서 short form과 long form의 두 종류의 isoform으로 분류된다. 포유류 세포의 세포질에 존재하는 short form은 높은 효소 활성(1,800 U/mg)을 나타내며, 진핵생물이나 미토콘드리아에 존재하는 long form은 매우 낮은 활성(200 U/mg)을 나타낸다. 한편, 박테리아인 Mycobacterium tuberculosis의 AK(AKmt)는 활성은 long form의 전형적인 낮은 활성을 갖고 있지만, 구조적으로는 진핵세포와 같은 short form인 것으로 밝혀졌다. 본 연구에서 사람의 AK1(hAK1)과 AKmt의 효소의 촉매활성에 중요한 부위인 P-loop의 아미노산 서열 중 활성이 높은 isoform과 활성이 낮은 isoform에서 serine(Ser19hAK1)과 alanine(Ala11AKmt)으로 각각의 보존성이 상이하여 이 부분이 효소 활성에 미치는 영향을 분석하였다. 부위지정 돌연변이법을 이용하여 hAK1의 19번째 Ser을 Ala으로 치환시킨 돌연변이체(S19AhAK1)를 작성하여 hAK1 및 AKmt간의 활성 및 기질 친화도를 반응속도론적으로 비교한 결과 S19AhAK1의 활성은 357 U/mg으로 AKmt 수준으로 낮아졌으나, 기질 친화도인 Km 값은 ATP 및 AMP에 대하여 큰 변화를 보이지 않았다. 이로서 P-loop의 serine은 side chain의 polarity를 통해 phosphoryl-transfer의 촉매기능을 촉진하고 있음을 확인하였다.; Adenylate kinase (AK) is a ubiquitous enzyme which related with the energy metabolism in living cells. AK has two kinds of isoforms: short form and long form. Generally the short form has high enzymatic activity (1800 U/mg) and exists in eukaryotic cytosol, while long form has low activity (200 U/mg) and exists in mitochondria and bacteria. Interestingly, AK from Mycobacterium tuberculosis (AKmt) belongs to the short form isozyme, but catalytic activity is as low as that of bacterial long forms'. To characterize this discrepancy, we shed light on the conserved residues in the p-loop of the enzyme. In the flexible P-loop of AK, serine is conserved in high-activity isozymes and alanine is conserved in low-activity isozymes, respectively. Ser19 of high activity hAK1 is replaced by Ala at Ploop in low activity AKmt. We substituted Ala for Ser19 in hAK1 by site-directed mutagenesis to get a mutant enzyme, S19AhAK1. Enzyme activity of S19AhAK1 was greatly reduced to 450 U/mg, as expected. However, minor changes in Km values for both of ATP and AMP were detected. In conclusion, the serine19 in hAK1 enhances the phosphoryl-transfer catalysis but not in substrate binding, by utilizing the polarity in p-loop environment.