Regulation of Nanog expression

Abstract

Nanog은 배반포 (blastocyst)와 배아줄기세포(embryonic stem, germ, and carcinoma cells)에서 발현되는 homeodomain protein의 일종인 전사인자로서 배반포의 내세포괴(inner cell mass; ICM)나 배아줄기세포의 원시내배엽(primitive endoderm)으로의 분화를 억제 시킴으로써 전분능을 유지시키는 주된 기능을 수행한다. 본 연구에서, 저자는 인간배아줄기세포에서nanog의 alternative spliced variant을 동정하였다. 이 단백질은 nanog 유전자4번째 exon 개시부위48개의 염기가 결손된 형태로서, 이 결손부위는 48 bp로 구성된 염기서열의 3말단 3-splice site인 “AG”와 그 앞쪽 (5’upstream)으로 polypyrimidine tract을 지니고 있어 alternative splicing (intron)의 조건을 완벽하게 충족시키므로 alternative splicing 에 의해 형성된 형태임을 알 수 있었으며, nanog-delta48이라 명명하였다 결손부위 해당아미노산은 (잔기 168-183)은 DNA결합능을 지닌homeodomain (HD) 과 C-terminal transactivation domain tryptophan-repeat domain (WR)사이에 존재하므로, DNA linker로서 작용 할거라 예측하였다. 전분능(pluripotency)을 지닌 ES cell과 다분능(multipotency)을 지닌 각종 전구 세포(progenitor cells)에서 Nanog-delta 48의 발현을 살펴보았다. 전분능ES 세포에서는 nanog 의 발현량이 nanog-delta48에 비해서 두드러지게 많았으나, 다분능 세포에서는 nanog-delta48의 발현수준이 거의 비슷한 수준을 나타내었다. Nanog 예상 결합 DNA 서열에 대한 결합능 (DNA binding capacity) 을 알아보기 위해EMSA를 수행한 결과, nanog과 nanog-delta48 모두 같은 수준의 DNA 결합능을 지님이 관찰되었다. 또한 전사활성능을 분석하기 위해서 gata 4 promoter와 co-transfection 하여Reporter assay를 수행하였을 때는, nanog-delta48이 nanog과 거의 동등한 수준으로 gata4- promoter의 전사활성을 억제하였다. 이러한 관찰들을 종합해 볼 때, alternative spliced variant 인 nang-delta48은 비록 nanog과 발현양상과 1차 구조에 있어 차이를 나타내지만, DNA 결합능과 전사 활성능에 있어서는 nanog과 비슷한 수준을 지니고 있음을 알 수 있었다. 다음으로는 전분능을 지닌 F9 teratocarcinoma 세포에서 Nanog 발현과 PI3K/Akt 신호와의 관련성을 연구하였다. 이를 알아보기 위해 본 저자는 F9세포에 RA를 72 시간 동안 처리, 내배엽으로의 분화를 유도 시켰다. 미분화상태F9 세포에서 일정한 수준이상의 발현을 보이던 Nanog은 RA를 처리 시 일시적인 증가현상을 보이다가 분화중반부터 감소하였다. 한편Akt및 GSK 3β 인산화 수준은 RA에 의하여 초반부 증가와 후반부에 2차 증가로 두 차례의 증가를 나타내었다.저자는 RA를 처리, 분화유도 시 초반부 증가되는 Nanog의 발현과 인산화 되는 Akt와의 연관성을 가정하였다. Nanog발현과 PI3K/Akt 신호 활성간에 관련성을 살펴보기 위해, F9 cell에 RA를 처리하여 내배엽으로 분화 유도 시에 PI3K inhibitor인 LY294002를 동시 처리하여 Nanog 발현 변화를 살펴보았다. 분화 초기 시 LY294002에 의해서 Nanog발현이 억제가 이루어지나, 분화가 진행됨에 따라서 그 억제효과가 미미하였다. 게다가 LY294002를 농도별로 처리한 후 각 시간대별로 회수한 F9 세포의 단백질에서 Nanog의 발현량을 살펴보았을 때는, 오직 분화 초반부에서만 PI3K/Akt 신호 억제에 의해서 영향을 받았다. 이들 결과들은 Nanog의 발현은 분화초기단계에서 활성화된 Akt 의해서만 영향을 받는다는 것을 나타내준다. 또한 RA 단독처리 시 24 시간동안 지속적인 증가를 보이던 Nanog promoter 의 전사 활성능에 있어서도, LY294002를 동시에 처리하여 PI3K/Akt 신호를 억제 시에는 점진적인 감소추이를 나타내었다. 한편 원시내배엽으로의 분화가 어느 정도 확립된 상태에서 PI3K/Akt 신호와 Nanog발현과의 연관성을 더 자세히 살펴보기 위해서, 48 시간동안 RA를 처리하여 이미 분화를 성립시킨 F9 세포에 LY294002를 24 시간동안 처리한 후 Nanog 의 발현변화를 관찰하였다. 분화 초반부와는 달리 PI3K/Akt 신호억제에 의한 Nanog 발현 감소현상이 보이지를 않았다. 이러한 관찰들을 종합해 볼 때, 본 연구는 RA에 의해서 F9 세포를 분화 유도 시, 분화초기Nanog의 발현을 위해서 PI3K/Akt 신호체제가 필요하지만, 이미 분화가 진행된 중간단계부터는 Nanog 의 발현은 PI3K/Akt 신호에 독립적으로 작용한다는 것을 시사하고 있다.; The homeodomain protein Nanog has been a key factor that maintains the pluripotency by inhibition of differentiation of embryonic stem, carcinoma, and germ cells to primitive endoderm lineage. We initially identified an alternatively-spliced variant of human nanog. This variant lacked a stretch of amino acids (residues 168-183) located between the homeodomain protein (HD) and tryptophan-repeat (WR) of the previously-reported full length sequence, suggesting that the deleted sequence functions as a linker and possibly affects the flexibility of the C-terminal transactivation domain relative to the DNA binding domain. Expression of mRNA encoding the splice variant, designated as nanog-delta 48, was much lower than that of the full length version in human ES cells. The ratio of nanog-delta 48 transcript to full length transcript increased, however, in multipotent adult progenitor cells. EMSA analysis revealed that both forms of Nanog were able to bind a Nanog binding sequence with roughly the same affinity. A reporter plasmid assay also showed that both forms of Nanog repressed transactivation of gata-4 with comparable potency modestly. We conclude that, despite the differences in primary structure and expression pattern in various stem cells compared to the full length version of Nanog, the alternatively-spliced variant of Nanog has similar transcriptional activity and DNA binding capacity to that of the full length version. Secondly, we examined that the involvement of phosphoinositide 3 kinase (PI3K) /Akt signal pathway in murine nanog expression during retinoic acid (RA)-induced differentiaiton of F9 cells to primitive endoderm lineage. We cultured F9 teratocarcinoma cells for 72 h in the presence of RA to induce differentiation to primitive endoderm. Nanog mRNA and protein were constitutively expressed in undifferentiated F9 cells. However expression of nanog protein and transcript was transiently upregulated and thereafter diminished during differentiation of F9 cells to primitive endoderm. Phosphorylation of Akt and GSK3β increased in a biphasic manner upon treatment with RA. These results imply that nanog correlate with the early phase activation of phosphorylation pattern of Akt and GSK3β. We then examined the dependence of Nanog expression on the activation of Akt by simultaneous treatment with RA and LY294002, an inhibitor of PI3K/Akt. Nanog expression at the early stage was attenuated by the inhibitor, but it was insensitive to the inhibitor at the late stage of differentiaiton. Furthermore, when different concentrations of LY294002 were used to see the dependence of Nanog expression on the phosphorylation pattern of Akt, Nanog expression was only dependant on phospho-Akt at the early stage of differentiation. Therefore, these results show that Nanog expression could be affected by Akt activation at only the early stage of differentiaiton of F9 cells. The transcriptional activity of nanog promoter increased up to 24 h and thereafter decreased in the absence of LY294002, whereas in the presence of LY294002 the transcriptional activity of nanog steadily decreased throughout the differentiaiton, in agreement with decreased Nanog by LY294002. However, once differentiation of F9 cells was established by treating with RA for 48 h, Nanog expression was no longer decreased by inhibiting Akt phosphorylation. Collectively, our results suggest that RA-induced PI3K/Akt activation at the early stage of differentiation is required for Nanog expression, which becomes independent of PI3K/Akt signaling at the late stage.