생쥐 배아 할구-유래 배아줄기세포를 이용한 내분비계 장애물질의 세포 독성 평가

Abstract

줄기세포란 신체의 각 기관별 고유의 기능을 담당하는 여러 종류의 특정 세포로 분화할 수 있는 잠재성을 보유한 세포를 일컬으며, 성체의 여러 조직에 존재하는 것으로 알려진 성체줄기세포와 착상전의 초기 배아로부터 유래되는 배아줄기세포의 두 종류로 크게 구분할 수 있다. 이 중 미분화 상태로 무한히 증식할 수 있는 능력과 신체를 구성하는 모든 종류의 세포로 분화할 수 있는 전분화능을 보유하고 있는 배아줄기세포는 재생의학 분야에서 세포치료제의 무한한 세포 공급원으로서 가치를 인정받고 있다. 현재 배아줄기세포에 관련된 다양한 분야의 관심은 크게 증가되어 있지만, 줄기세포가 의생명과학 분야에 실질적으로 활용되기 위해서는 여러가지 기술적, 윤리적 문제점들을 가지고 있다. 특히, 현재의 배아줄기세포 확립 기술 수준에서는 배아줄기세포를 확립하기 위하여 하나의 생명체로 발생할 수 있는 가능성을 가지고 있는 배아를 파괴해야만 한다. 이러한 문제점은 배아줄기세포의 의생명과학분야에서의 적용을 제한하는 가장 큰 윤리적 문제점이라 할 수 있다. 현재 일부 연구자들이 배아를 파괴하지 않고 배아줄기세포를 확립할 수 있는 기술 개발에 대한 연구를 진행하고 있으며, 이러한 기술의 개발은 배아줄기세포의 활용을 제한하는 가장 큰 윤리적 문제점을 해결하기 위하여 필수적이라 할 수 있다. 배아줄기세포의 활용이 예상되는 또 다른 분야는 신약개발 및 독성평가, 특히 생식독성학 분야이다. 다양한 신약 및 독성 물질들은 그 화합물의 구조 및 활성에 따라 발생 단계별로 상이한 효과를 나타낸다고 보고되고 있다. 현재의 신약개발 및 독성학 분야에서는 각종 조직에서 직접 채취한 일차세포배양 또는 기존에 이미 확립되어 있는 형질이 전환된 세포주를 이용하여 신약 및 독성 물질의 효능과 부작용에 대한 검사를 실시하고 있다. 그러나 기존에 이용되고 있는 이러한 방법은 검사를 위한 충분한 세포의 공급 부족, 배양 기간의 제한, 이수성과 같은 염색체 이상의 발생 등에 기인하여 효율적인 분석 및 분석결과의 신뢰성을 확보하는데 여러 한계점을 안고 있다. 또한 기존에 사용되고 있는 이러한 세포들은 이미 최종적으로 분화가 종료된 세포들로서, 특정 세포가 형성되는 각 단계별 발생과정에 미치는 약물과 독성물질의 효과를 검사할 수 없는 제한을 가지고 있다. 따라서, 이러한 제한성은 특정 약물이나 독성물질의 영향으로 인해 모체 내에서 발달하고 있는 초기 배아 혹은 태아의 특정 세포 및 기관의 형성 저해에 대한 평가를 불가능하게 한다. 반면 배아줄기세포의 경우, 생체에서 일어나는 기관의 발생과 유사한 세포, 유전학적 기전을 통해 다양한 종류의 특정세포로 분화되며, 따라서 분화과정에서 존재하는 각 단계별 전구세포에 대한 약효 및 독성평가가 가능하다. 현재 배아줄기세포의 이러한 장점을 이용한 신약 및 독성물질에 대한 검사기법으로서 ‘배아줄기세포 검사 (EST, Embryonic Stem Cell Test)’는 그 가능성을 인정받고 있으며, 이에 따라 배아줄기세포 검사의 가능성과 개발에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있다. 그러므로, 본 연구는 첫째, 할구생검을 이용하여 배아를 파괴하지 않고 배아줄기세포를 확립하는 기술을 정립하고, 둘째, 독성물질의 일종인 내분비계 장애물질, mono-(2-ethylhexyl)-phthalate (MEHP)를 배아줄기세포에 처리하여 배아 독성을 세포생물학적으로 분석하며, 셋째, 배아줄기세포로부터 유도분화된 신경전구세포에 동일한 내분비계 장애물질을 처리한 뒤, 그 영향을 분석함과 동시에 미분화 배아줄기세포와 분화된 신경전구세포에서 보이는 독성물질에 대한 민감도의 차이 및 그 의미성을 분석하기 위하여 실시하였다. 제 1장에서는 C57BL/6J 생쥐의 2-세포기 배아에서 할구를 분리한 후 할구를 이용한 배아줄기세포 확립 기술을 정립하였다. 38개의 배아에서 76개의 할구를 분리한뒤 배양한 결과, 72개의 할구가 포배기 배아까지 발생하였으며 (94.7%), 이 중 69개의 배아를 STO 세포주와 공배양하여 총 2개의 생쥐 배아줄기세포주를 확립하였다 (2.9%). 할구를 이용한 배아줄기세포 확립 효율을 비교하기 위하여 배아를 이용하여 동일한 방법으로 배아줄기세포주를 확립하였다. 139개의 배아를 배양한 결과, 모든 배아가 포배기 배아까지 발생하였으며 (100%), 10개의 생쥐 배아줄기세포주가 확립되었다 (7.2%). 확립된 할구-유래 배아줄기세포는 정상적인 생쥐 배아줄기세포와 마찬가지로 전형적인 다층 반구의 형태를 보였으며, 전분화능 세포 특이적 표지 인자인 alkaline phosphatase, 세포 표면 항원인 SSEA-1과 미분화 전사인자인 Oct4의 발현이 지속적으로 유지되는 것을 확인하였다. 체외에서 부유배양 시 할구-유래 배아줄기세포는 일반 배아줄기세포와 형태적으로 동일한 배아체를 형성하였으며, 이 배아체가 내, 외, 중배엽의 삼배엽성 세포들에 대한 특이적 유전자를 모두 발현하고 있음을 관찰하였다. 이와 더불어, 자연 분화를 통하여 신경세포와 심근세포로의 분화를 확인하여 확립된 배아줄기세포주가 다분화능을 유지하고 있음을 검증하였다. 또한, 확립된 할구-유래 배아줄기세포들은 50계대 이상 지속적인 배양이 가능하였고, 동결 및 융해 후에도 배아줄기세포의 전형적인 특성들을 유지하였다. 그러므로 본 연구를 통하여 배반포가 아닌 할구로 부터 정상적인 배아줄기세포주와 동일한 특성을 보유하는 세포주를 확립함으로써, 윤리적인 문제를 극복하여 배아를 파괴하지 않고 전능성을 보유하는 배아줄기세포가 확립될 수 있는 가능성을 제시하였다. 제 2장에서는 배아줄기세포를 이용한 배아독성평가의 가능성을 검증하기 위하여 우리 주변에 광범위하게 존재하는 내분비계 장애물질의 일종인 MEHP를 할구로 부터 확립된 생쥐 배아줄기세포에 처리하였다. 100, 500, 1,000 μM의 MEHP, 혹은 양성대조군으로서 1 μM의 actinomycin D (ActD)를 생쥐 배아줄기세포에 처리한 뒤 24, 48시간 후에 분석한 결과, 1,000 μM의 MEHP 처리군에서 배아줄기세포의 생존률이 유의하게 감소하는 것을 확인하였다 (P<0.01). 처리 후 12, 24 시간에 500, 1,000 μM의 MEHP를 처리한 실험군에서 배아줄기세포의 세포자연사가 유의하게 증가됨이 관찰되었으며 (P<0.05), 면역화학적 검사 결과, 세포자연사의 신호전달과정에서 중요한 역할을 담당하는 caspase-3의 활성화 형태인 cleaved caspase-3의 발현 역시 현저하게 증가되는 것을 확인하였다. MEHP 처리 24시간 후 세포의 미세구조를 투과 전자현미경으로 관찰한 결과, 100 μM의 농도에서 MEHP는 배아줄기세포의 미세구조의 변형을 유발하였으며, 일부 세포에서는 세포자연사가 개시되는 것을 확인할 수 있었다. 한편 500, 1,000 μM의 MEHP는 배아줄기세포의 미세구조에 많은 영향을 주었으며, 대부분의 배아줄기세포에서 핵응축, 미토콘드리아 내에 액포 형성, 세포 간격의 확장 등 세포자연사의 특징들이 관찰되었다. MEHP에 의한 배아줄기세포의 세포자연사와 연관된 분자생물학적 기전을 이해하기 위하여, Bcl-2와 caspase 계열 유전자의 mRNA 발현 양상을 RT-PCR기법으로 분석하였다. MEHP는 mRNA 수준에서 이들 유전자들의 발현에 영향을 주지 않았으나, MEHP 처리 후 배아줄기세포의 형태 변화를 관찰할 수 있었고, 미분화 전사인자인 Oct4의 발현이 단백질 수준에서 감소하는 것을 Western blot방법으로 확인하였다. 본 연구를 통하여 내분비 장애물질인 MEHP는 미분화 생쥐 배아줄기세포에서 세포자연사를 유발하며, 전능성 유지에 필수적인 전사인자의 발현을 저해할 수 있음을 확인하였다. 본 연구결과에서 관찰된 MEHP-유발성 배아줄기세포의 세포자연사는 추후 다각적인 실험접근 방법을 통하여 그 분자생물학적 기전이 밝혀질 것으로 사료되나, 배아를 파괴하지 않는 할구-유래 배아줄기세포가 기존의 배아줄기세포검사(EST) 검사 방법에 상응하는 독성학 검사에 활용될 수 있음을 확인할 수 있었다. 제 3장에서는 MEHP가 신경계의 세포발달에 미치는 영향을 알아보기 위하여 할구-유래 배아줄기세포로부터 신경세포의 전구세포인 신경전구세포로의 분화를 유도한 뒤, 분화중인 배아체 및 분화된 신경전구세포에 미분화 생쥐 배아줄기세포에서와 동일한 농도의 MEHP과 ActD를 처리하여 그 영향을 확인하였다. 500 μM의 MEHP는 배아체 형성에 심각한 영향을 주어 배아체를 구성하는 세포들의 사멸을 유발함을 관찰할 수 있었으며, 1,000 μM의 MEHP는 그 비율을 더욱 증가시킴을 알 수 있었다. 더불어 MEHP는 배아체의 발달과정에서 삼배엽성-특이 유전자와 생식세포-특이 유전자의 발현에 영향을 주는 것으로 관찰되었다. 외배엽-특이 유전자 중에서 FGF5의 발현은 100 μM의 MEHP 처리군에서 유의하게 (P<0.05) 증가하였다. 500 μM의 MEHP가 처리된 배아체에서는 nestin과 Pax6의 발현이 각각 유의하게 (P<0.05) 감소 또는 증가하였다. 500 μM의 MEHP가 처리된 배아체에서는 중배엽-특이 유전자들 중에서 brachyury의 발현은 유의하게 (P<0.05) 감소하였고, 특히 내배엽-특이 유전자인 Sox17과 AFP의 발현을 확인할 수 없었다. 생식세포-특이 유전자들 중에서 c-kit과 Dazl의 발현은 500 μM의 MEHP 처리 후 각각 유의하게 (P<0.05) 감소 또는 증가하였다. MEHP의 처리는 그 외 다른 일부 유전자들의 발현을 증가 또는 감소시켰으나 통계학적으로 유의하지는 않았다. MEHP 처리 후, 신경전구세포의 생존률은 농도-의존적으로 감소하였고, 1,000 μM 이상의 고농도에서만 유의적인 세포생존률의 감소가 나타난 미분화 줄기세포와는 달리, 100 μM 이상 처리한 세포에서도 생존률이 유의하게 감소함을 확인하였다 (P<0.001). 면역화학적 검사를 통하여 500 μM 이상의 MEHP는 신경전구세포에서 caspase-3를 활성화 시키는 것을 확인할 수 있었으나, mRNA 수준에서는 MEHP가 조직 특이적 인자인 Tuj1의 발현에 영향을 주지 않음이 관찰되었다. 본 연구를 통하여 MEHP는 배아체의 정상적인 발달, 즉 정상적인 삼배엽성세포와 생식세포의 분화에 영향을 미침을 알 수 있었다. 또한 신경계 발생의 전구세포인 신경세포의 비정상적 형태 변화를 유도하고 및 생존률을 감소시킴으로써 MEHP가 초기 발생과 분화 과정에서 잠재적 신경독성을 나타낼 수 있음을 확인하였다. 결론적으로, 본 연구는 배아를 파괴하지 않고 할구를 이용하여 배아줄기세포를 확립할 수 있는 기술을 정립하였으며, 이렇게 확립된 할구-유래 배아줄기세포는 다양한 독성 물질 및 환경오염 물질들의 독성 특히, 배아독성을 보다 명확하게 분석하는데 응용될 수 있는 가능성을 제시하였다. 본 연구 결과로부터, 내분비계 장애물질인 MEHP가 미분화 배아줄기세포와 배아줄기세포로부터 분화 유도된 신경전구세포의 세포자연사를 증가시키는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 배아줄기세포, 배아체, 신경전구세포의 순으로 이어지는 각 분화단계에 따라 MEHP의 독성에 대한 민감도가 다르게 나타나는 것도 확인할 있었다. 따라서, 배아줄기세포를 이용한 배아독성 및 신경독성 평가는 기존의 독성검사에서 제한적이었던 초기 발생 및 분화과정 동안의 특정 물질의 독성을 검증하는데 있어 유용하게 이용될 수 있을 것으로 사료된다.; Stem cells have the ability to proliferate continuously and they can differentiate into the various types of cells that make up the organism, under the adequate conditions. Stem cells are classified into two kinds of cells according to their origin: embryonic stem (ES) cells and adult stem cells. To date, many attempts have been made to use human embryonic stem (ES) cells in regenerative medicine, where ES cells are envisioned to be potential resources for cell or tissue replacement therapies. However, researches using human ES cells raise a number of ethical issues in that derivation of human ES cells requires the destruction of intact embryos. Several approaches have recently been reported to overcome this ethical problem: the production of ES cell lines using parthenogenetically activated oocytes (parthenogenetic embryonic stem [pES] cells), somatic cells nuclear transfer (SCNT), somatic cell chromosome transfer (SCCT) into mitotic mouse zygotes, and isolated blastomeres from cleavage stage embryos. Beside therapeutic potentials, ES cells are also expected to provide a new platform for drug discovery and toxicity screening of new drugs, testing chemicals or environmental contaminants. To date, most information on the action mechanisms of new drugs and toxicants have been derived from animal testing or in vitro studies using primary mammalian cells, immortalized tumor cells or genetically transformed cells. However, these strategies are limited by several factors, including a limited survival rate and genetic abnormality that would occur during long-term culture. In contrast to primary cells and immortalized cells, stem cells offer considerable advantages in that they are genetically normal, highly permissive to genetic manipulation and shows uniform physiological responses. The sensitivity of hazardous effects of the toxicants may differ according to the developmental and differentiational state of the target cells and tissues. In in vitro differentiation of ES cells, cellular and tissue differentiation and the expression pattern of genes are thought to be similar to that of normal developing mammalian embryos. Therefore, ES cells could be very useful in screening test for new drugs and wide range of toxicants, especially reproductive toxicants. The present study was carried out to establish ES cell lines using isolated blastomeres without destruction of embryos and to use these cell lines to evaluate the effect of mono-(2- ethylhexyl)-phthalate, one of the major endocrine disruptor on the developmental process, particularly on neurogenesis. In chapter 1, two mouse ES cell lines were established from 76 isolated single blastomeres of mouse 2-cell embryos (2.9%) and ten mouse ES cell lines were established from 139 blastocysts from intact embryos (7.2%). The established ES cell lines from isolated blastomeres showed the typical characteristics of mouse ES cells. Morphologically, they formed the tight, round and multi-layer clumps and efficiently formed embryoid bodies (EBs) upon suspension culture. They showed a high level of alkaline phosphatase (AP) activity and expressed the mouse ES cellspecific surface marker, SSEA-1 and the pluripotency marker, Oct4. The genes specific for embryonic three germ layers were detected from EBs. In addition, they retained developmental competence and differentiated into multi-lineage, including neurons and cardiomyocytes. These cell lines continued to show the characteristics of mouse ES cells over 50 passages and after freezing and thawing as well. These results, therefore, demonstrate that ES cell lines derived from isolated single blastomeres of preimplantation embryos have comparable properties found in pluripotent mouse ES cells. In chapter 2, the blastomere-derived ES cells were treated with an endocrine disruptor mono-(2-ethylhexyl)-phthalate (MEHP) to evaluate the potential embryonic toxicity. The cell viability was significantly decreased in the cells treated with 1,000 μM of MEHP at 24 and 48 hrs after treatment (P<0.05). The TUNELpositive cells were significantly increased in the cells treated with 500 and 1,000 μM of MEHP at 12 (P<0.02) and 24 hrs (P<0.05) of treatment. In addition, the number of active caspase-3-postive cells was increased after treatment of MEHP. Moreover, apoptotic features, such as nuclear condensation, were frequently observed in 100 μM of MEHP-treated cells. In transmission electron microscopy, mouse ES cells exposed to 500 and 1,000 μM of MEHP and 1 μM of ActD displayed the typical morphologies of apoptotic cells, including nuclear condensation, swelling of nucleus membrane, enlargement of intercellular space, and abnormal vacuoles in mitochondria and cytoplasm. Treatment of ES cells with MEHP changed the pluripotent state of ES cells in that the expression of pluripotent marker (Oct4) was decreased in a dosage-dependent manner at the protein level. In chapter 3, to evaluate whether MEHP can influence the neural differentiation during the early development, the blastomere-derived ES cells were differentiated into EB and then neural progenitors. MEHP was treated at the stage of EB and neural progenitor generation. A high level of cell death was observed during EB formation when more than 500 μM of MEHP were treated to EB. The expressions of genes specific for embryonic three germ layers and primitive germ cells were analyzed by semi-quantitative RT-PCR. Expressions of genes specific for ectoderm were significantly changed after treatment of MEHP. Expression of FGF5 was significantly (P<0.05) increased when 100 μM of MEHP was treated to mouse EB. Expression of nestin was significantly (P<0.05) decreased and expression of Pax6 was significantly (P<0.01) increased when 500 μM of MEHP was treated to mouse EB. Among genes specific for mesoderm, expression of brachyury was significantly (P<0.05) decreased after mouse EBs were treated with 500 μM of MEHP. Interestingly, expressions of Sox17 and AFP specific for endoderm, were not detected in EB when 500 μM of MEHP were treated. Among genes specific for primitive germ cells, expression of c-kit was significantly (P<0.05) decreased whereas expression of Dazl was significantly (P<0.05) increased when mouse EBs were treated with 500 μM of MEHP. Expressions of other genes were decreased or increased after treatment of MEHP, but there were no significant differences. When MEPH was treated to neural progenitor cells differentiated from mouse ES cells, cell viability was decreased in a dosage-dependent manner at 24 and 48 hrs after treatment of MEHP. Unlike undifferentiated mouse ES cells, the cell viability was significantly decreased at 24 and 48 hrs after more than 100 μM of MEHP were treated (P<0.001) and caspase-3 were activated after 500 μM of MEHP were treated to neural progenitor cells. However, the mRNA expression of tissue-specific marker genes was not changed after treatment of MEHP. Importantly, the present study suggests that the response and sensitivity to the toxicants may be different depending on the status of differentiation. Taken together, this study demonstrates that ES cells can be established from isolated single blastomeres without destruction of embryos and the blastomerederived ES cells might be very useful in the fields of screening test for the potential candidates of a wide range of toxicants.