Identification of Genes Specifically Expressed in Human Stem Cells and Functional Analyses of the Genes Using RNAi Strategy

Abstract

배아줄기세포는 모든 세포로 분화할 수 있는 배아시기의 세포로부터 유래되었으며 자가복제능력과 전분화능을 가지고 있다. 이러한 특징들로 인하여 배아줄기세포는 체외에서 포유동물 발생의 모델로 사용되며, 형질전환 생쥐의 제조에도 이용될 뿐만 아니라 재생의학에서 세포치료를 위해서도 이용될 수 있기 때문에 이들을 적절히 이용하고 응용하기 위해서는 자가복제 및 전분화능의 분자적 기작을 이해하는 것이 필수적이다. 본 연구는 인간 배아줄기세포와 조혈줄기세포 (CD34^(+), CD133^(+)) 그리고 간엽줄기세포를 대상으로 대단위적인 유전자발현 분석 방법인 cDNA microarray를 이용하여 줄기세포의 특성을 나타내는 분자적 기작을 밝히고자 하였다. 그 결과 인간 배아줄기세포에서 특이적으로 발현하는 유전자로서 전사인자인 TFAP2C와 MYCN, RNA 결합 단백질인 IMP-3와 기능이 알려지지 않은 MAGEA4 등을 동정하였다. 그리고 발생 기작을 살펴볼 수 있는 유전자들로 세가지 인간 줄기세포주에서 공통적으로 증가하는 22개의 유전자와 공통적으로 감소하는 141개의 유전자들을 동정하였다. 본 연구에서 얻은 인간 성체줄기세포의 유전자 발현 양상 결과는 자가복제능력뿐만 아니라 다양한 계통으로의 특이적인 분화경로를 밝히는데 중요하게 이용될 수 있을 것이다. 앞서 언급한 바와 같이 인간 배아줄기세포는 이들이 가진 고유한 특징 때문에 기초 및 응용연구에서 아주 중요한 도구로 사용된다. 그러나 이러한 연구를 위해서는 인간 배아줄기세포를 유전적으로 변형시킬 수 있는 효과적인 방법이 개발되어야 한다. 본 연구에서는 잠재적으로 줄기세포능을 가진 유전자들의 기능을 이해하기 위해 RNAi를 이용한 유전자 발현감소 방법을 개발하였다. 먼저 RNAi를 이용하여 유전자의 발현감소를 유도할 수 있는 유도성 레트로바이러스 벡터 시스템을 개발하였다. 이 벡터는 돌연변이된 TATA box 결합단백질이 결합할 수 있도록 변형된 U6 프로모터를 가지며, 돌연변이된 TATA box 결합단백질은 테트라사이클린에 의해 조절되는 TRE 에 의해 조절된다. 이 유도성 RNAi 벡터의 유용성은 외부에서 도입한 EGFP 및 세포내에 발현하는 STAT3 의 발현 조절능력을 통해 확인되었다. 하지만 이 벡터는 인간 배아줄기세포에서 낮은 유전자 도입효율을 보였다. 따라서 최근 인간 배아줄기세포에서 효율적인 유전자 도입 방법으로 제시된 렌티바이러스 벡터를 이용하여 테트라사이클린에 의해 외부 도입유전자와 RNAi를 동시에 조절할 수 있는 벡터를 개발하였다 (pLenti-Dual I/O, pLV-tetO-EF1α-MCS-tetO-H1). 이 벡터는 외부 유전자 발현조절을 위한 RNA 중합효소 II EF1α 프로모터와 RNAi 발현을 위한 RNA 중합효소 III H1 프로모터을 가지고 있으며 이들 프로모터는 테트라사이클린에 의해 조절된다. 이 벡터의 효율성은 다양한 세포주와 생쥐 배아줄기세포에서 pLV-RFP-EGFPi를 이용하여 테트라사이클린 유무에 따른 유전자 발현조절을 확인함으로써 증명되었다. 마지막으로 인간 배아줄기세포에 렌티바이러스를 효율적으로 도입시키기 위한 방법을 개발하였다. 도입 효율을 증가시키기 위해 영양세포주의 유무와 같은 배양조건 및 Matrigel, Retronectin등의 다양한 증가 시약들을 이용하였으며, 그 결과 Matrigel에서 배양하면서 polybrene과 lipofectamin 2000을 조합하였을 때 도입 효율이 가장 높음을 확인하였다. 이러한 방법을 이용하여 생쥐 배아줄기세포에서 JAK2의 기능과 MMTR의 기능을 분석하였으며, 인간 배아줄기세포에서 STAT3, JAK2, WDHD1, STELLAR, GDF3에 대한 기능을 분석하였다. 요약하면, 줄기세포의 자가복제능, 전분화능 그리고 분화에 대한 분자적 기작을 이해하기 위해, 첫 번째로 다양한 인간 줄기세포 (인간 배아줄기세포, 인간 조혈줄기세포, 인간 간충직줄기세포)들 간의 유전자 발현양상을 비교하여 줄기세포가 가진 분자적 특이성을 찾고자 하였다. 두 번째로 이를 통하여 얻어진 잠재적 줄기세포 특이 유전자의 기능을 분석하고자, 레트로바이러스 및 렌티바이러스를 이용한 테트라사이크린 유도성 RNAi 벡터를 개발하고, 인간 배아줄기세포에 렌티바러스를 도입하기 위한 효율적인 방법을 개발하였다. 마지막으로 이 방법을 이용하여 생쥐 및 인간 배아줄기세포에서 자가복제능에 관여하는 유전자와 초기 분화에 관여하는 유전자의 기능을 분석하였다. 본 연구에서 얻어진 결과는 줄기세포에 대한 이해와 포유동물 발생 분화에 대한 이해를 증진시킬 것이며, 세포치료 및 재생의학을 이용하기 위한 생물학적 기반을 제공할 것이다.