Hedgehog 신호전달에 의한 생쥐 정소 내 Leydig cell의 조절 및 분화

Abstract

Hedgehog (Hh)는 초파리에서 처음으로 발견된 신호 전달 분자로, 이 ligand에 의한 신호전달은 세포증식을 유도하고 세포생존을 촉진하며 배아발달과정에 있어 분화를 조절한다. 고등척추동물은 Sonic (Shh), Indian (Ihh), Desert (Dhh) hedgehog 등 세 가지 Hh 유전자를 갖고 있다. 이 중 Dhh는 정소조직에서만 발현하는 Hedgehog로 germ cell 증식에 관여한다고 알려져 있다. Dhh는 Sertoli cell에서 분비되며 fetal Leydig cell의 분화를 촉진하는 paracrine factor로 작용한다. 본 연구는 Hh 신호전달이 각 시기별 정소의 발달과 Leydig cell의 분화 및 조절에 미치는 영향을 규명하기 위해 생쥐에서 출생 후부터 성체에 이르는 동안 정소 내 Hh 신호 전달 과정에 관여하는 유전자들의 발현 여부를 확인하였다. 또한 androgen 및 anti-androgen에 의한 Leydig cell 내 Hh 신호전달 분자들의 발현 변화를 조사하였다. Optimized semiquantitative RT-PCR로 생쥐 정소 내 Hh 신호 전달 과정에 관여하는 유전자들의 mRNA의 발현을 분석한 결과, Dhh, Ptch2, Smo, Gli1, 2, 3 모두 생후 7일과 14일 째에 높게 발현하였고, 사춘기 이후부터는 발현이 급격하게 감소하는 것을 확인하였다. 면역염색화학법으로 그 발현 위치를 확인한 결과, Dhh는 Sertoli cell에서 발현하였고, Ptch2와 Smo는 주로 Leydig cell에서 발현하였다. 또한 Hh 신호전달의 target gene activator로 작용하는 Gli1은 생후 14일 이후 spermatogonia에서 매우 높게 발현하는 것을 확인하였다. 1주령 정소 조직을 체외에서 배양하고, 각각 Hh 신호전달의 activator와 inhibitor로 작용하는 cyclopamine (Cyc)과 purmorphamine (Pur)을 처리하여 Hh 신호 전달에 관여하는 유전자들의 mRNA 발현을 분석하였다. Cyc 처리시 Ptch2와 Gli1 mRNA 발현이 감소한 반면 Pur 처리시 농도의존적으로 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 4주령 생쥐의 Leydig cell의 1차배양 후 Cyc와 Pur 처리시에도 Ptch2와 Gli2, Gli3 mRNA 발현에서 유사한 결과를 나타내었다. 성체 정소에서 anti-androgen인 flutamide (FTM)를 고농도로 처리시 Dhh, Ptch2, Gli1 mRNA의 발현이 증가하였다. Smo mRNA는 FTM의 농도에 따라 의존적으로 발현이 감소하였으나, Gli2와 Gli3는 고농도에서만 발현량이 약간 감소하는 경향을 보였다. 면역염색화학법으로 발현 위치의 변화를 확인한 결과, Ptch2와 Smo가 Leydig cell에서 발현하였는데, FTM 고농도에서는 그 발현이 미약해지는 것을 확인하였다. 마지막으로 adult mouse Leydig cell의 primary culture 후 각각 5α-DHT, testosterone, FTM를 처리한 후, steroidogenesis의 변화를 살펴본 결과, 17β-HSD는 FTM 처리시 발현량이 증가하였다. 또한 Hh 신호전달에 관여하는 유전자들의 mRNA 발현변화를 살펴본 결과, Gli1 mRNA는 androgen에 의해 발현량이 감소하였고, FTM 100uM에서 발현양이 크게 증가하는 것을 확인하였다. 결론적으로, testis so Sertoli cel에서 분비되는 Dhh는 Leydig cell의 분화를 촉진하는 paracrine factor로 추정되며, Dhh 신호전달은 출생 이후 정소에서 정자형성과정과 Leydig cell의 발달 및 분화 등 정소 발달에 관여하고 있는 것으로 사료된다.; Hedgehog(Hh) is a cell-signaling molecule that was first discovered in Drosophila spp. Hh signaling is involved in cell proliferation, cell survival, and differentiation during embryonic development. In contrast to the single Hh gene present in Drosophila, higher vertebrates have three Hh genes, Sonic (Shh), Indian (Ihh), and Desert (Dhh). Dhh is secreted by the Sertoli cell and binds to its receptor Patched2 (Ptch2) on the surface of Leydig cells, relieving repression of Smoothened (Smo), which mediates downstream signaling events. In this study, to verify possible function and regulation of Hh signaling in Leydig cell differentiation, spatiotemporal expression of genes involved in Hh signaling was examined in the mouse testis and isolated Leydig cells. In addition, the effect of antiandrogen as well as androgen on the expression of genes involved in Hh signaling were investigated in cultured mouse Leydig cells. Optimized semi-quantitative RT-PCR analysis revealed that mRNA levels of Dhh, Ptch2, Smo, and Gli1, 2, and 3 were relatively high at postnatal day (PND) 7 and 14 and then markedly decreased at PND28 onward. In the mouse testis, Dhh was found in Sertoli cells; Ptch2 and Smo were mainly localized in Leydig cells. Strong immunoreactivity of Gli1, hedgehog target gene activator, was found in spermatogonia. In organ cultured mouse testis, cyclopamine decreased the expression of Ptch2 and Gli1 mRNA. purmorphamine, however, increased. In pubertal mouse Leydig cell primary culture, cyclopamine decreased the expression of Ptch2, Gli2, and Gli3 mRNA. Whereas flutamide (FTM), an anti-androgen, increased expression of Dhh, Ptch2 and Gli1 at high doses, In adult mouse testis, FTM dose-dependently decreased the expression of Smo mRNA. Expression of Gli2 and Gli3 mRNA was a little decreased by FTM at high doses. In primary mouse Leydig cell primary culture, Gli1 mRNA level was decreased by androgen but increased by FTM, suggesting the tight coupling between Gli1 dependent transcription and androgen in Leydig cell. Taken together, spatiotemporal changes in the expression of genes for Hh signaling during postnatal development suggest functional involvement of Hh signaling in differentiation of Leydig cell and male germ cell in testis.