Transcriptional and Post-translational Regulatory System for Hypoxia Specific Gene Therapy

Abstract

혈관내피세포성장인자(VEGF)를 이용한 혈관 신생 치료는 심장 혈관 질병 치료의 새로운 치료 전략으로 주목 받고 있다. 그러나, VEGF 의 발현이 정상적으로 조절되지 않을 경우 혈관종, 망막증, 종양 생성 등의 부정적 결과를 가져올 수 있다. 따라서, 안전하고 성공적인 유전자 치료를 위해서는 조절 가능한 유전자 발현 시스템이 필요하다. 본 연구에서는 oxygen dependent degradation(ODD)도메인과 에리스로포이에틴(Epo) 를 가지고 있는 저산소 유도성의 루시퍼레이즈 발현 벡터인 pEpo-SV-Luc- ODD 를 제작하였다. Epo 인핸서와 ODD 도메인은 저산소 상태에서 293 세포, neuro2A 세포, 프라이머리 심장근육세포에서 유전자 발현을 효과적으로 증가시켰다. 반면, 루시퍼레이즈 mRNA 레벨은 저산소와 정상 산소 상태에서 큰 차이가 없었다. 그러므로, 정상 산소 환경 에서 루시퍼레이즈의 활성 감소는 번역 전 단계의 전사율 변화 또는 mRNA 안정성 등에 의한 것이 아니라 번역 후의 분해로 인한 결과임을 확인 할 수 있었다. 또한, 저산소 유도성의 VEGF 발현 백터인 pEpo-SVVEGF- ODD 를 제작하여 쥐 허혈성 심근에 주입하였으며, pEpo-SV-VEGF 와 식염수는 대조군으로 사용하였다. 유전자 주입 5 일 후, 모든 그룹에서 VEGF 의 발현이 증가했으며, pEpo-SV-VEGF-ODD 그룹에서 VEGF 발현이 가장 많이 증가하였다. Masson’s trichrome 염색과 알파 평활근액틴 (α-SMC)염색으로 pEPO-SV-VEGF-ODD 주입 그룹이 다른 그룹에 비하여 섬유소성 면적이 가장 작게 생성되었음을 확인하였다. 또한 pEpo-SVVEGF 주입 그룹에서 심장근육세포의 세포사멸이 감소되었음을 확인하였다. 이와 같은 결과들로 보아 ODD 도메인과 Epo 인핸서를 이용한 저산소 유도성 유전자 발현 시스템은 허혈성 심장 질환의 치료에 있어서 유용할 것으로 생각된다.; Therapeutic angiogenesis with vascular endothelial growth factor (VEGF) is a promising strategy for the treatment of cardiovascular diseases. However, uncontrolled expression of VEGF can induce adverse effects such as tumor growth, hemangioma, and retinopathy. Thus, the controllable gene expression systems are required for safe and successful gene therapy. In this study, a hypoxia-inducible luciferase expression vector with the oxygen dependent degradation (ODD) domain and the erythropoietin (Epo) enhancer, pEpo-SV-Luc-ODD, was constructed. The combination of the Epo enhancer and the ODD domain effectively increased gene expression in 293 cells, Neuro2A cells and primary cardiomyocytes under hypoxia. However, the luciferase mRNA levels under hypoxia and normoxia were not significantly different. Therefore, decrease of luciferase activity under normoxia is not due to pre-translational events such as change of transcription rate or mRNA stability, but to post-translational degradation. The hypoxia-inducible VEGF expression vector, pEpo-SV-VEGF-ODD, was constructed and injected iv into rat ischemic myocardium. pEpo-SV-VEGF or normal saline was injected as a control. Five days after gene transfer, VEGF expression increased in all groups, and the highest expression was obtained in the pEpo-SV-VEGF-ODD group. Masson’s trichrome staining and α-smooth muscle actin (α-SMA) staining showed significantly less fibrotic areas in the pEpo-SV-VEGF-ODD group as compared with other groups. In addition, apoptosis of cardiomyocytes was reduced in the pEpo-SV-VEGF-ODD group. These results demonstrate efficacy of hypoxia-inducible gene expression system with ODD domain and Epo enhancer in ischemic heart disease.