Mycobacterium tuberculosis acetohydroxyacid synthase 재조합 단백질의 특성, 저해제 스크리닝 및 mutant 연구

Abstract

Acetohydroxyacid synthase (AHAS; EC 2.2.1.6)는 필수 아미노산 중, Valine, Leucine, Isoleucine을 합성하는 과정에서 ThDP와 FAD를 cofactor로 하여 첫 단계 촉매 반응을 하는 효소이다. AHAS는 미생물이나 식물에서는 발견되지만 동물은 가지고 있지 않은 효소이기 때문에 동물 질병 연구의 표적이 될 수 있다. 본 연구에서는 Mycobacterium tuberculosis AHAS 효소의 촉매 소단위체 유전자를 pET28a 발현벡터에 삽입시켜 대장균 BL21(DE3)에서 발현시켜 정제하였다. 정제된 AHAS 효소의 SDS-PAGE 전기영동법을 통한 분자량은 68.3 kDa임을 확인하였다. Specific activity는 2.8 U/mg이었으며, pyruvate의 Km은 7.36 mM, ThDP와 Mg2+의 Ks는 각각 45.43 mM, 0.531 mM이었다. 식물 제초제를 목표로 많은 연구가 수행된 AHAS에 대한 결핵균 저해 가능성을 찾기 위해 M. tuberculosis AHAS mutant 4개를 만들었다. AHAS의 wild type과 mutant들에서 저해를 일으키는 화합물을 찾기 위하여 226개의 scaffold 화합물을 스크리닝 하였다. 이 중 6개의 화합물의 IC50값을 알아본 결과, AVS 2087은 0.28 μM, AVS 2093은 0.21 μM, AVS 2236은 3.88 μM, AVS 2397은 2.5 μM, KSW 30191은 38.2 μM, chemical 147은 76.2 μM이었다. 이중 강한 저해효과를 보이는 화합물 5개를 선택하여 저해 유형을 알아본 결과, AVS 2093은 무경쟁적 저해(uncompetitive inhibition)로, AVS 2087, AVS 2236, AVS 2397, KSW 30191은 비경쟁적 저해(noncompetitive inhibition)로 나타났다. AHAS mutant들에 대한 저해 가능한 화합물들의 저해 정도를 알아보기 위하여 mutant 4개의 효소 활성을 알아보았다. 그 결과, 4개의 mutant 모두 효소 활성이 매우 낮게 나타났다. 이 때문에 저해 가능한 화합물의 저해 정도를 알아보기 어려웠다. 이에 mutant의 활성이 낮게 나타나는 이유를 mutant를 만들었을 때 wild type의 구조나 기능의 변화일 것이라 생각하여 tryptophan fluorescence의 quenching을 이용하여 ThDP와의 결합력을 알아보았다. 그 결과, wild type은 Ks 값이 0.6 mM이었으나, E100Q는 1.9 mM, E100D는 0.36 mM, D495E는 0.35 mM, D495N은 4.9 mM으로 나타났다. Wild type의 Ks값과 비교해 보면 E100D는 0.36 mM, D495E는 0.35 mM로 큰 차이를 보이지 않았지만, E100Q는 1.9 mM으로 약 3배, D495N은 4.9 mM으로 약 8배의 차이를 보였다. 이는 아미노산의 성질에 따른 종류에 기인하는 것으로 보인다. E(글루탐산)와 D(아스파르트산)는 마이너스의 전하형 R기의 아미노산이며, Q(글루타민)와 N(아스파라긴)은 극성의 비전하형 R기이다. 즉 같은 성질을 갖는 아미노산으로 변이시켰을 경우에는 Ks값에 큰 변화를 보이지 않으나 다른 성질을 갖는 아미노산으로 변이한 경우는 Ks값이 크게 증가하여 ThDP와의 결합력이 매우 약해진 것으로 보인다. 이는 ThDP가 아미노산에 결합하는 부위의 잔기에서의 전하 차이에 기인하는 것으로 보인다. 이는 mutant를 만들기 위하여 새로운 잔기를 삽입한 부분이 효소 활성에서 매우 중요한 구조임을 보여준다.; Acetohydroxyacid synthase (AHAS, EC 4.1.3.18) catalyzes the first step in the biosynthesis of the branched-chain amino acids. AHAS is a thiamin diphosphate- (ThDP-) and FAD-dependent enzyme that catalyzes the first common step in the biosynthetic pathway of the branched-amino acids such as leucine, isoleucine, and valine. The enzyme has a large subunit containing the catalytic machinery and a small subunit with a regulatory role. The small subunit may affect feedback regulation, enzymatic activity, and stability. The catalytic subunit of AHAS gene from Mycobacterium tuberculosis was cloned into the bacterial expression vector pET28a and expressed in the Escherichia coli strain BL21(DE3). The expressed enzyme was purified by Ni2+ -charged Hi Trap chelating HP column. The molecular mass of catalytic subunit is around 68.3 kDa. The specific activity of catalytic subunit was 2.8 U/mg. The Km value for pyruvate was 7.36 mM, whereas the Ks values for cofactor (ThDP and Mg2+) were 45.43 μM and 0.531 mM, respectively. The dissociation constant of ThDP were 0.6 mM by tryptophan fluorescence quenching. Through lots research, AHAS was known as the target enzyme of herbicide. In this study, we screened inhibitors of M. tuberculosis AHAS using 226 chemical library. Six chemicals that inhibited AHAS activity, were selected and tested IC50 in the range of 0.21 ~ 76.2 μM. Based on IC50 values, 5 chemicals were selected showing strong inhibition and inhibition mechanism was assessed. AVS 2093 was uncompetitive and remained 4 chemicals AVS 2087, AVS 2236, AVS 2297, KSW 30191 were noncompetitive inhibitors. Four M. tuberculosis mutants were constructed to study affinity and catalysis in the presence of cofactors, however, all mutants showed low enzyme activities. Because of structural and functional changes, each mutant enzyme activity was very low. To understand structural and functional changes in mutants, quenching study was done. Affinity of wild type and mutants for ThDP were 0.6 mM and 0.35~4.9 mM, respectively. In these mutants, the highest Kd was 4.9 mM for D495N, showing low binding affinity with ThDP. That indicates important role of mutated residues in AHAS enzyme activity.