이종이식을 위한 미니돼지 유전자 발현 연구

Abstract

이종이식 (xenotransplantation)은 서로 다른 종간의 세포, 조직, 혹은 장기를 이식 하는 것인데, 이는 동종 이식시 장기 부족에 따른 해결책이라 할 수 있다. 그러나 이종이식을 성공시키기 위해서는, 이식후에 기증자 (recipient)와 수여자 (donor)의 면역적 거부반응을 제거해야 한다. 이 면역적 거부반응은, 초급성 거부반응 (hyperacute rejection), 급성거부반응 (acute vascular rejection), 만성거부반응 (delayed xenograft rejection), 세포-매개 거부반응 (cell-mediated rejection)과 같이 다양한 종류가 있다. 이러한 면역장벽을 극복하기 위해서는, 이종이식시 사용되는 미니돼지에 대한 유전자의 이해가 필요하다. 첫 번째로 본 연구에서는, 돼지 유전자에 대한 oligo 13K 칩을 제작하였다. 돼지 oligo 칩은 유리 슬라이드 위에 70 nucleotide 길이의 oligonucleotide를 부착시키고, microarray 기술을 이용하여, 특정 조건에서의 유전자 발현 변화를 폭넓게 탐지 할 수 있는 기술이다. 돼지 probe를 부착 시킨 후에, syto 61 염색 방법, post-processing, 재현성 테스트를 하여, 유리 슬라이드 위의 probe 상태를 확인하였다. 부가적으로, 돼지 oligo 13K 칩에 찍혀 있는 유전자들을 GeneSpring 7.2를 사용하여 기능적으로 분류하였다. 그리고, KEGG PATHWAY database와 NCBI GENE database를 같이 이용하여, 유전자들을 pathway별로 분류하였다. 그리고 KEGG pathway diagram를 시각적으로 보여주는 web-based 기술인 Korea Pig Omics Database (KPOD)를 개발하여, 기존에 연구가 많이 되어 있지 않은, 미니돼지에 대한 연구를 하기 위해, 처음으로 돼지 oligo 칩과 KPOD라는 database를 구축 하였다. 두 번째 연구에서는, 일반돼지와 미니돼지와의 간과 췌장에서 RNA를 추출하여 microarray 실험을 하였다. 미니돼지의 간과 췌장에서 발현되는 transcriptomes을 분석 한 결과, 미니돼지 간에서, collagen III, VI, VIII, XIV, alpha I 유전자들이 adult 단계에서 높게 발현되었다. 이전의 연구에서, 미니돼지의 collagen 구조가 6개월 후 발생단계에서 인간과 비슷하다는 결과가 보고된 바 있다. 그리고 보체 (complement) group 유전자들이 E60 (embryonic day 60), P1 (postnatal day 1)에서 특이적으로 발현이 되는 반면, adult 단계에서는 발현이 안 되는 경향을 보였다. 또한, 미니돼지 췌장에서는, keratin (KRT7)과 vimentine (VIM)이 adult 단계에서 발현율이 높아졌다. KRT7과 VIM은 pancreatic 세포의 증식에서 높게 발현된다고 알려져 있다. 이 결과는 장기 크기와 발생단계가 이종이식을 할 경우 중요한 역할을 한다는 것을 강하게 지지해준다. 그러므로, 미니돼지 간에서 collagen과 보체 유전자들의 발현, 미니돼지 췌장에서, KRT 7과 VIM 유전자 발현을 보았을 때, 이종이식은 adult 간과 신생췌장을 사용하는 것이 적절하다고 사료 되었다. 세 번째 연구에서는, 미니돼지혈관내피세포 (porcine aortic endothelial cells)에 5가지 면역 자극제 (H2O2, hTNF-?, pIFN-?, LPS and MCP-1)를 처리하여 유전자 발현을 연구했다. 이종이식시 혈관내피세포는 수여자의 장기와 기증자의 장기가 처음으로 만나는 부분이며, type II 내피세포 반응과 cytokine 분비가 일어나는 곳이다. 면역 자극제를 처리하기 전, 본 연구에서, 안정적인 미니돼지혈관내피세포 (PAEC)를 획득하였고, 내피세포 마커인 PCAM-1과 VCAM-1으로 그 안정성을 확인하였다. 미니돼지혈관내피세포에 1hr, 6hr, 24hr에 RNA를 추출했고, 돼지 oligo 13K chip을 사용해서 microarray 실험을 한 후, qRT-PCR을 하여 microarray 결과를 확인했다. 특이적으로 발현된 유잔자들 중, chemokine (CXC motif) ligand 6 (CXCL6), cathepsin S는 사람내피세포뿐만 아니라 미니돼지내피세포에서도 유도된다. 그리고, CITED2는 transcriptional modulator로서, 모든 stimulators와 모든 시간대에서 높게 발현한다. 이 유전자가 발현이 되면, anti-apoptotic signaling이 일어나게 되는데, 이종이식시 이 유전자는 항상 발현이 되는 positive 마커로 사료되었다. 또한, 흥미롭게도, SFRP2, RSAD2, SSRP1는 미니돼지내포세포에서는 특이적으로 overexpressed 되는데, 사람내피세포에서는 특이적으로 발현되지 않는다. 그 중, SFRP2 유전자는 WNT 신호전달을 막음으로써, transcription을 방해하는 유전자이다. 따라서, 이종이식 성공을 위해, SFRP2는 이종이식 전에 block를 시켜야 하는 negative 마커라 사료되었다. 결과적으로, 미니돼지 간과 췌장의 발생에 따른 유전자발현의 연구는 이종이식에 중요한 정보를 주었다. 또한, 미니돼지혈관내피세포 활성에 따라 많은 유전자들이 overexpression 되는데, 이 유전자들 중에서 일부 유전자는 특이적으로 미니돼지혈관내피세포에서 발현이 되나, 사람내피세포에서는 발현되지 않았다. 이 유전자들은 이종이식과 관련이 있으며, 면역반응에 참여하는 candidate 유전자라 사료되었고, 그들은 더 나아가서 이종이식에서 잠재적으로 타겟이 될 가능성이 있는 유전자라 사료 되었다.; Xenotransplantation is the transplantation of living cells, tissues, or organs from one species to another. This method provides a potential solution to the severe shortage at human organ for transplantation. However, xenograft rejection remains a profound hurdle to successful xenotransplantation. The primary hurdle to xenotransplantation in this regard is the immunological barrier between the organ and the recipient after transplantation. The humoral and cellular immune systems are involved at different stages over the course of events. These defense mechanisms result in the destruction of the organ, a process referred to variously as hyperacute rejection (HAR), acute vascular rejection (AVR), delayed xenograft rejection (DXR), cell-mediated rejection, and chronic rejection First, we conducted fabrications using Pig Oligo 13K chips. The oligonucleotide microarray, which is composed of gene-specific oligonucleotides 70 nt in length spotted onto glass slides, has become a powerful tool for the global detection of gene expression changes. All probes were designed using The Institute of Genome Research (TIGR) Gene index Database SsGI Release 5.0. After the spotting of the pig probe, we assessed the probe retention characteristics of the Pig Oligo 13K chip, via syto 61 stanning, post-processing, and reproducibility tests. Additionally, the Pig Oligo 13K chip contents are annotated by GeneSpring 7.2 and are cross-linked between the KEGG PATHWAY database and the NCBI GENE database. And we developed the Search of KPOD (Korea Porcine Omics Database): a web-based tool for the visualization of the KEGG pathway diagrams of omics data. Second, we assessed gene profiling in the liver and pancreas between the domestic pig and the miniature pig. In the case of the liver and pancreas, whole-organ xenotransplantation and implantable devices appear to be unfeasible due to the complexity of the metabolic processes. We extracted total RNA from the liver and pancreas for the microarray experiment. We analyzed differentially expressed transcriptomes in the pancreas and liver of miniature pigs and domestic pigs. In the pig liver, collagen type III, VI, VIII, and XIV, alpha 1 was overexpressed in adult stage of pig liver. In previous study, it is reported that, the collagen structure is similar to human in adult stage. And complement groups significantly changes expression at E60 (embryonic day 60) and P1 (postnatal day 1). But, in adult stage, no change in expression is observed in the complement genes. In the pig pancreas, keratin 7 (KRT7) and vimentin (VIM) are overexpressed at adult stage. KRT7 and VIM is overexpressed in proliferation of pancreatic cell. This result strongly supports the notion that organ size and development stages are important to xenotransplantation. Therefore, xenotransplantation may be successes with adult liver and neonatal pancreas. Finally, we assessed the transcriptional profiling of inflammatory stimulator (H2O2, human TNF-α, porcine IFN-γ, LPS and MCP-1)-responsive genes in porcine aortic endothelial cells (PAECs). In this study, we established quiescent porcine endothelial cell lines and activated them with hTNF-α, pIFN-γ, H2O2, LPS and MCP-1. RNA was prepared after 1 hr, 6 hr, and 24 hr, and was utilized for transcriptional profiling using a pig oligonucleotide 13K microarray and quantitative RT-PCR. A few mRNA species, including chemokine (CXC motif) ligand 6 (CXCL6), and Cathepsin S were confirmed to be induced not only in human endothelial cells but also in porcine endothelial cells. And Cbp/p300-interacting transactivator, with Glu/Asp-rich carboxy-terminal domain, 2 (CITED2) is over expressed with all stimulators at 1, 6, and 24hr. Interestingly, several mRNA species, including secreted frizzled-related protein 2 (SFRP2), radical S-adenosyl methionine domain containing 2 (RSAD2), and structure specific recognition protein 1 (SSRP1) were significantly overexpressed in porcine endothelial cells, but were not prominent in human endothelial cells. Therefore CITED2 may be always expressed after xenotransplantation as positive marker and SFRP2 may be blocked before xenotransplantation for successful xenograft. Taken together, our results indicate that the study of genes expressed during the development of the liver and pancreas in the pig is very important information in xenografting. Also, gene overexpression accompanies porcine endothelial cell activation, and some of these genes are overexpressed exclusively in porcine, but not human, endothelial cells. These genes and their products represent candidates that participate in xenotransplantation-specific immune reactions; moreover, they represent potential targets for drug development tailored toward xenotransplantation.