유전자 치료를 위한 선택적 고효율 유전자 발현 시스템의 개발

Abstract

VEGF를 이용한 치료용 혈관생성은 허혈성 질병의 치료에 가능성을 갖고 있다. 그러나 VEGF의 발현은 종양을 생성할 수 있는 부작용을 갖고 있다. 이전의 연 구에서 우리는 산소 결핍 상태에서 특이적으로 유전자 발현을 하는 Epo enhancer-SV40 프로모터 시스템을 개발하였다. 본 연구에서는 기존 프로모터 시스템에 HIF1α를 함께 transfection하여 산소 결핍 상태에 훨씬 더 특이적으로 발현할 수 있는 시스템을 개발하였다. pSV-HIF1α로 명명한 이 유전자는 pSI 벡 터에 HIF1α cDNA를 넣어서 디자인 하였다. pSV-HIF1α를 pEpo-SV-Luc에 1:1 의 비율로 함께 transfection을 하였을 때 Epo enhancer-SV40 프로모터가 가장 높은 효율을 보였으며 이것은 산소 결핍 상태에서 pEpo-SV-Luc만 처리하였을 때보다 적어도 3배 이상 유전자 발현을 높이는 것으로 나타났다. 게다가 이것은 산소 결핍 상태에 상당히 특이적으로 반응하였다. 또한 pEpo-SV-VEGF에 pSVHIF1α를 함께 transfection한 결과 pEpo-SV-VEGF만 넣어주었을 때보다 VEGF 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. 그리고 pSV-HIF1α는 angiopoietin-1과 같 은 내생적으로 산소 결핍 상태에 반응하는 유전자의 발현을 유도하는 것으로 보 아 혈관생성에 효과적일 것으로 생각된다. 따라서 pSV-HIF1α와 pEpo-SVVEGF를 함께 transfection하는 것은 산소 결핍 상태에 특이적일 뿐 아니라 유전 자 발현을 더 증가시키므로 허혈성 질환의 유전자 치료에 효과적일 것이다. GLP-1은 베타세포에서의 인슐린 분비를 조절하는 유전자로서 2형 당뇨병의 치료에 효과적일 것으로 여겨지고 있다. 그러나 이것은 원형질에서 DPP-IV라는 효소에 의해 빠르게 분해가 되어 그 기능을 잃는다. 이러한 문제점을 극복하기 위해 GLP-1과 같은 기능을 하면서 DPP-IV에 의해 분해되지 않아 반감기가 상 대적으로 더 긴 EX4가 개발되었다. 이번 연구에서는 EX4의 세포 외 분비를 촉 진하여 더 효율적으로 작용하게 하기 위하여 EX4의 cDNA에 분비 신호 펩티드 를 합성하였다. 그 결과, 분비 신호 단백질이 EX4의 발현과 베타 세포의 생존 능력을 증가시킴을 확인하였다. 따라서 이 분비 신호 단백질은 EX4의 2형 당뇨 병 치료 능력을 더 증가시키는데 효율적일 것으로 여겨진다.; Therapeutic angiogenesis with gene encoding vascular endothelial growth factor (VEGF) is a potential treatment for ischemic diseases. However, VEGF expression should be tightly regulated to avoid side effects such as tumor growth. Previously, our laboratories have developed the erythropoietin (Epo) enhancer-SV40 promoter system for hypoxia specific gene expression. In the present study, the activity of the Epo enhancer-SV40 promoter system was further enhanced without significant compromise of its specificity by co-transfection of the HIF1α gene. pSV-HIF1α was constructed by the insertion of the HIF1α cDNA into pSI. At a 1:1 ratio, the cotransfection of pSV-HIF1α and pEpo-SV-Luc increased the promoter activity of the Epo enhancer-SV40 promoter system, showing at least 3 times higher gene expression under hypoxia as compared with the pEpo-SV-Luc single plasmid transfection. The co-transfection of pEpo-SV-VEGF with pSV-HIFα also showed the enhanced VEGF expression without loss of hypoxia specificity, compared to pEpo-SV-VEGF single plasmid transfection. Furthermore, pSV-HIF1α induced the endogenous hypoxia responsive genes such as angiopoietin-1, which would be beneficial for therapeutic angiogenesis. Therefore, with hypoxia specificity and higher gene expression, the co-transfection of pSV-HIF1α and pEpo-SV-VEGF may be useful for ischemia targeting gene therapy. Glucagon-like peptide-1 (GLP-1) modulates insulin secretion from islet beta cells. Therefore, GLP-1 was considered as a potential therapeutic gene for the treatment of type II diabetes. However, it rapidly degraded in the plasma by DPP-IV and loses its activity. To overcome the problem, we developed recombinant EX4 similar to GLP-1 in function but have longer half-life. In this study, to increase the effect of the EX4, ligate the secretion signal peptide to the EX4 cDNA. So, EX4 and signal peptide act a single protein. Signal peptides promote an extracellular secretion of EX4. And then, signal peptide is released at golgi by furin recognition site which locate between signal peptide and EX4 cDNA. As a result, secretion signal peptides enhance the EX4 expression. Expression of EX4 increased the viability of β cells. This result indicated that EX4 is a useful strategy for gene therapy of type II diabetes therapy. The increase the expression and secretion of EX4 by secretion signal peptide also will be useful to increase this therapeutic effect of EX4.