고감도 면역분석 및 능동적 세포전달을 위한 리포좀 기반 생기능성 나노입자 개발

Abstract

리포좀은 지질 이중막으로 이루어진 생체친화적 물질이다. 리포좀은 양쪽 친매성 성질을 갖고 있어 화장품, 약물제제, 보조제(adjuvant) 등 생물화학공학의 여러 분야에서 주목을 받고 있다. 이들은 특히 내부의 친수성 공간에 형광물질, 약물, 효소 등의 친수성 물질들을 포집할 수 있다는 장점으로 여러 분석법에도 사용된다. 본 연구에서는 리포좀을 면역분석법과 능동적 세포 전달을 위한 생기능성 나노리포좀에 대한 연구를 진행하였다. ‘리포좀을 이용한 면역분석반응(liposome immunoassay, LIA)’에서는 HRP(horse radish peroxidase)가 포집된 리포좀 외부 표면에 항체를 고정화시킨 새로운 마커(marker)를 개발함으로써 일반적인 면역분석반응의 낮은 검출한계를 개선시켰다. 새로운 고감도 면역분석용 마커를 이용하여 다중시료 분석을 위한 마이크로 어레이칩에 적용하였다. 마이크로 어레이칩에서는 고체 표면의 성질이 단백질의 활성에 영향을 준다. 일반적으로 많이 사용하는 폴리스티렌(polystyrene, PS)과 광학적 특성이 좋은 폴리메틸메타아크릴레이트(polymethylmetacrylate, PMMA)에서의 단백질 고정화량과 단백질 활성을 비교하였다. 폴리스티렌 표면에서 LIA로 검출한 경우가 EIA로 검출한 경우 보다 검출한계(LOD, limit of detection)를 약 16배 향상시켰으며(LIA: 39 ng/mL, EIA: 0.6 ug/mL), 폴리메틸케타아크릴레이트 표면에서도 검출한계(LIA: 9.8 ng/mL, EIA: 0.16 ug/mL)를 약 16배 향상시켰다. 또한 LIA의 경우 1 ug/mL 이하의 농도를 검출하는 것이 효과적이었다. 1 ug/mL 이하의 농도에서는 리포좀의 공간적 제약(steric hindrance)로 인해 포화되는 것을 확인하였다. 이와 더불어 폴리메틸메타아크릴레이트 표면에 폴리스티렌 표면보다 단백질이 더 많이 고정화되는 것을 확인하였다. 또한 고체표면위의 anti-rabbit IgG 활성을 비교해 본 결과 폴리스티렌 보다 폴리메틸메타이크릴레이트에서 약 2배 이상 높은 것을 확인하였다. 이는 폴리스티렌 표면에 있는 벤젠기와 단백질 간의 소수성 결합에 의해 단백질의 활성이 감소되는 것으로 생각된다. ‘리포좀을 이용한 능동적 세포 전달’ 연구에서는 리포좀을 목적 세포에 보다 효과적으로 전달하기 위한 연구를 진행하였다. 리포좀 외부 표면에만 고정화되는 물질(BAM, biocompatible anchor molecule)을 이용하였으며 세포와 리포좀 간의 이미징을 통하여 검증하였다. 첫째, 리포좀과 대식 세포간의 상호작용은 리포좀 크기에 따라 달라진다. 이를 확인하기 위하여 100, 200, 400 nm의 리포좀을 준비하고 대식세포와의 상호작용을 관찰한 결과 400 nm의 리포좀이 100, 200 nm의 리포좀 보다 약 1.7배 정도 높게 대식세포와 반응한다는 것을 알 수 있었다. 또한 100 nm와 200 nm의 반응 상수를 비교해 본 결과 100 nm가 200 nm에 비해 약 1.2배 높은 것을 확인하였다. 결과적으로 순환계에서 대식작용을 피할 수 있는 리포좀은 200 nm인 것을 알 수 있었다. 둘째, 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)을 리포좀 표면에 고정화하여 대식작용을 감소시킨다(“stealth effect”). BAM 수식된 리포좀과 일반 리포좀의 대식세포와의 상호적용을 관찰한 결과BAM 수식된 리포좀은 일반 리포좀에 비해 약 2배 정도 낮게 결합하는 것을 알 수 있었다. 마지막으로 암세포 표면에 발현되어있는 수용체와 결합하는 리간드 물질을 리포좀 표면에 고정화하여 보다 효과적인 능동적 세포 전달을 확인하였다. 유방암세포에 과발현되어 있는 상피성장인자수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR)와 결합할 수 있는 상피성장인자(epidermal growth factor)를 BAM을 이용하여 리포좀 표면에 삽입시켰다. EGFR이 과발현되어 있는 유방암세포와 EGFR이 없는 유방암세포를 대상으로 실험한 결과, EGF가 고정화된 리포좀이 EGFR 과발현 유방암세포에만 결합하는 것을 알 수 있었다. 결론적으로 리포좀 표면을 EGF와 PEG로 수식함에 따라 보다 효과적인 약물 전달체를 개발할 수 있었으며, BAM을 이용하여 PEG와 EGF를 동시에 리포좀 표면에 수식을 할 수 있었다. 이와 같이 리포좀 내부 공간 또는 표면을 원하는 물질로 포집 또는 결합시킴으로써 일반적인 면역반응분석법이나 약물 전달체보다 효과적인 결과를 얻을 수 있었다.; Liposome is one of popular materials in biotechnology due to the special characteristics: hydrophilic inner space inside liposome and hydrophobic space between liposome bilayers. In this study, liposome was used for two applications: liposome immunoassay and active cell targeting. For both applications, the surface of liposome was biofunctionalized with antibody and recombinant human epidermal growth factor. One of application of liposome is immunoassay. Liposome has been used in an immunoassay field, because it has a large cavity inside. Fluorescent or colorimetric markers can be encapsulated inside liposome and generate higher signal. Therefore, marker encapsulated liposomes are very useful to detect a small amount of analyte. However, the conventional liposome immunoassay has some disadvantages such as lysis step of liposome. It is very time consuming and laborious. In this study, a substrate for horse radish peroxidase (4-chloro-naphtol) was used. It can be penetrating into the liposome and be accumulated inside liposome. This makes the signal density increased. For application of liposome immunoassay without lysis to microarray chip, the interaction between the chip substrate (PS and PMMA) and immobilized protein was investigated. In the result, immobilized protein has higher specific binding activity on PMMA surface. In addition, to test the feasibility for microarray chip, the decreasing spot volume was tested. The signal density was not changed by liposome immunoassay. Therefore, it is shown that liposome immunoassay can be one of candidates for high sensitive and simple detection methods for microarray chip. Other application for liposome was active cell targeting. Fluorescent liposomes ranging from 100 nm to 400 nm were prepared by filtration method. To observe the active target efficiency, two model cell lines were used. One is a macrophage cell for Stealth effect. The other is a breast cancer cell for liposome active cell targeting. To avoid MPS (mononuclear phagocytic system), the effect of liposome size was tested. Within 3 h, all kinds of liposome were engulfed with macrophage but the total amount of phagocytotic liposome was different. 400 nm liposome was easily taken up by macrophage, and 200 nm liposome was relatively less taken up. For Stealth effect, liposomes were coated with PEG (polyethylene glycol) moiety by using BAM (biocompatible anchor molecule). The binding kinetics for BAM inserted liposome and unmodified liposome was similar to the macrophage cell, but the total binding amount of BAM inserted liposome was less. Therefore, it represented that the size of liposome is one of variables to avoid MPS and PEG moiety makes the binding amount of liposome to macrophage reduced. To evaluate the active cell targeting, rhEGF (recombinant human epidermal growth factor) was immobilized on 200 nm sized liposome. As the model cell lines, two cell lines were used: breast cancer cell with EGF receptor overexpressed (MDA-MB-231 cell) and without EGF receptor (MCF-7 cell) on the surface. After 1h incubation, rhEGF immobilized liposome only bound to the breast cancer cell with EGF receptor overexpressed but did not bind to the negative control cell line. Therefore, it shows that rhEGF immobilized liposome has high specific affinity to a target cell; it can be used as active cell targeting carriers.