베타 카로텐을 다량 생산하는 Dunaliella salina CCAP 19/18 돌연변이의 제작 및 동정

Abstract

본 연구에서는 Dunaliella salina CCAP 19/18에 돌연변이 유도체인 ethyl methyl suffocate(EMS)를 처리하여 눈에 띄는 색 변화를 보인 돌연변이주를 분리해내고, 이 돌연변이주의 생리적 특성을 분석하고 wild type과 비교하였다. EMS(ethyl methyl suffocate)처리를 통해 나온 돌연변이체 중 색소함량의 변화가 있는지를 알아보기 위한 방법으로 HPLC(High Performance Liquid Chromagraphy)를 사용함으로써 EMS(ethyl methyl sulfonate)를 이용해서 나오게 된 돌연변이주들의 여러 가지 변화들 중에서 색소에 의한 변화를 측정 할 수 있었다. 돌연변이 주들을 HPLC를 통해 색소 분석한 결과 β-carotene의 함량이 현저하게 많은 균주를 발견할 수 있었고 그것을 M202라고 불렀다. 이 M202가 대조군인 Dunaliella salina CCAP 19/18과 비교해 보았을 때 다른 성질에는 어떠한 것이 있는지를 알아보기 위해 HPLC를 이용하여 색소함량을 비교하였고 Oxygraph를 이용하여 광합성 효율을 비교하였으며 건조중량과 광학 현미경을 통해서 세포의 모양과 크기 그리고 무게를 비교하였다. 이 M202는 동일한 HPLC 조건에서의 대조군 D. salina CCAP 19/18과 비교한 결과 비교적 낮은 광도에서 많은 β-carotene을 생성할 수 있다는 사실을 알 수 있었는데, 400 μmol photons m^(-2)s^(-1) 의 광도에서 대조군 D. salina CCAP 19/18에 비하여 37배나 많은 β-carotene의 양을 가지고 있음을 보였고 β-carotene을 많이 함유하고 있는 Dunaliella bardawil에 비하여 1.2배정도 많은 β-carotene의 양을 세포 내에 축척하고 있다. 또한 세포의 크기 관찰과 건조 중량의 비교를 통해서 M202의 세포 하나하나가 대조군 D. salina CCAP 19/18보다 월등히 크고 무겁다는 사실을 알게 되었다. 또한 90 μmol photons m^(-2)s^(-1) 에서는 대조군 D. salina CCAP 19/18(건조중량 g당 2.53 × 10^(-8)g/cell)에 비하여 M202(건조중량 g당 6.84 × 10^(-8)g/cell) 가 2.7배 정도 무겁고 200 μmol photons m^(-2)s^(-1) 에서는 대조군 D. salina CCAP 19/18 건조중량 g당 3.27 × 10^(-8)g/cell)에 비하여 M202(건조중량 g당 6.25 × 10^(-8) g/cell) 가 1.9배 정도 무거웠다. 그리고 M202의 모양은 광학현미경으로 관찰하였고 광학현미경 (×400) 으로 관찰한 M202의 모양은 400 μmol photons m^(-2)s^(-1) 에서 대조군의 Dunaliella salina CCAP 19/18 (길이 : 10 μm폭 : 6 μm)보다 M202(길이 : 20 μm폭 : 20 μm)가 편모를 중심으로 하여 위아래로 나누었을 때 위쪽 부분이 양쪽으로 폭이 커진 것을 관찰 할 수 있었다. Dunaliella bardawil (길이 : 17 μm폭 : 10 μm) 과 비교해 보았을 때에는 최초의20 μmol photons m^(-2)s^(-1) 에서는 서로의 길이가 비슷한 것을 관찰 할 수 있었으나 광도를 높임에 따라 M202의 양쪽 폭이 Dunaliella bardawil 보다 커지는 것을 관찰 할 수 있었다. 또한 Dunaliella bardawil과의 Oxygen electrode를 이용한 산소발생량 측정을 통해 광합성 효율을 비교하였는데 2000 μmol photons m^(-2)s^(-1) 에서의 D. bardawil (12.25mmol O₂(mol Chl)^(-1)s^(-1))보다 M202 (92.25mmol O₂(mol Chl)^(-1)s^(-1))는 2000 μmol photons m^(-2)s^(-1) 에서 약 7.5배정도 높은 산소발생능력을 보였다.; In this research, we generated the Dunalliella salina CCAP 19/18 mutant by using chemical mutagenesis. Mutant strain showed distinctive color change compared to wild type(WT). This strain turned out to be accumulating higher level of β-carotene then the wild type, and named as M202. Further accurate comparison of pigment profiles of WT and M202 grown under different light intensity were performed by using HPLC. The change in morphology including shape and size was also compared under microscopy, and dry weight of wild type and M202 strains were measured. Photosynthesis rate was also measured by comparing oxygen evolving rate between M202 and D. bardawil. The result of HPLC analysis showed the drastically increased β-carotene level in M202 strain. From this analysis, HPLC is concluded that the M202 strain is able to accumulate much higher level of β-carotene under relatively lower light compared to wild type or D. bardawil. By comparing dry weight of the strains, we found that M202 cells are heavier than wild type cells. Cells of M202 grown under light of 90 μmol photons m^(-2)s^(-1) is 2.7 times much heavier than wild type and 1.9 time under light of 200 μmol photons m^(-2)s^(-1). The microscopy observation revealed that cells of M202 are bigger and incubation time. Photosynthetic efficient measuring oxygen evolution of M202 was about 7.5 times higher than D. bardawil in 200 μmol photons m^(-2)s^(-1). these results indicated that mutant strain may be a better candidate for β-carotene production in terms of low light requirement for mass cultivation.