활동성 정자 분리를 위한 생체환경 모사 마이크로바이오칩에 관한 연구

Abstract

The objective of this research is to develop a new bio-environmental mimetic microbiochip system for separation of motile sperm using biological characteristic of sperm. For this research, MEMS (Micro-Electro-Mechanical System) technology and micromolding technique were applied and PDMS (Polydimethysiloxane) and glass were used as materials of fabrication. To realize this new microbiochip system, research of this work is largely divided into three categories. First, a new microbiochip for separation of motile sperm was presented. Chemotaxis, a kind of biological characteristic of sperm was used in our microbiochip for separation of motile sperm. Chemotaxis is a cell movement directed by a concentration gradient of chemical. Therefore, our microbiochip was designed to form a concentration gradient along the microchannel due to diffusion of chemical and featured in a radial shape being made up of one inlet and eight outlets and microchannels for the purpose of high-throughput test. In our microbiochip, the fact that a concentration gradient was generated without any fluid control device was confirmed through fluorescent experiment using Rhodamine B as a fluorescent material. For the experiment, mouse sperm was used as a sample and acetylcholine was selected as chemoattractant. Using acetylcholine diluted with seven cases (1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16. 1/32, 1/64) and D.I water as a control, it was verified that mouse sperm showed the chemotactic response about the concentration gradient formed in microchannel. Through the experiment of separation of motile sperm, the optimal concentration gradient to the most strongly induce chemotaxis was obtained and reliability of experimental result was evaluated through the statistical analysis. Second, a novel microbiochip system was developed for separation of motile sperm using thermotaxis, cell movement directed by a temperature gradient. Developed microbiochip system is largely composed of microbiochip, microheater chip and temperature control system respectively. To use thermotaxis of mouse sperm and separate motile sperm in our microbiochip, it is very important issue to generate a temperature gradient in the microchannel. Therefore, a new type microheater chip that can generate a temperature gradient in the microchannel was designed. Proposed microheater chip was composed of two heaters and sensors. To obtain the feasibility of designed microheater chip and evaluate the temperature distribution of microheater and microbiochip, heat transfer analysis about microbiochip and microheater chip was performed by using commercial fluid analysis software, CFD-ACE+. In the result of analysis, applying different voltage to each heater, it was verified that temperature gradient was formed in the microchannel of microbiochip loaded on the microheater chip. To fabricate the microheater chip, ITO film (Indium Tin Oxide) was used because of good permeability, high electric conductivity. Microbiochip was also fabricated by using micromolding technique and temperature control system that can regulate the temperature of microbiochip through microheater and microsensor was constructed by using DAQ (Data Acquisition) card, signal conditioner and LabVIEW. Using constructed temperature control system and thermocouple, it was confirmed that temperature gradient was formed in the microchannel. Based on this result, the experiment of separation of motile sperm by using thermotaxis was performed in various temperature conditions. As a result of thermotaxis assay, the optimal temperature gradient to induce thermotaxis of mouse sperm the most strongly was obtained. Third, we constructed a bio-environmental mimetic integrated system that can simultaneously induce chemotaxis and thermotaxis of mouse sperm. We adopted the system used in thermotaxis assay to increase the efficiency of this research. Applying the optimal conditions of chemotaxis and thermotaxis assays to the constructed system, the experiment of separation of motile sperm was conducted and then the experimental result compared and analyzed with that of chemotaxis and thermotaxis assays.; 전세계적으로 환경호르몬, 스트레스, 불규칙한 식습관, 출산의 고령화로 인한 불임 부부의 수가 증가하고 있으며, 특히 최근에는 남성불임 요인이 증가 추세에 있다. 불임이라고 진단 받은 부부들은 정상적인 방법을 통한 수정이 불가능하기 때문에 체외수정(IVF, in vitro fertilization)이라 불리는 시험관 수정이나 세포질내 정자 주입법(ICSI, intracytoplasmic sperm injection)을 통해 인공수정 해야만 한다. 이러한 시술을 위해서는 운동성 있는 정자를 선별하기 위한 정자 처리과정(Sperm processing)이 반드시 필요하다. 기존의 정자 분리방식은 모두 원심분리기에 의해 정액에 포함되어 있는 다른 성분들과 정자를 분리하는 과정이 포함되어 있는데, 이것은 정자에게 치명적인 손상을 줄 수가 있다. 또한 대부분 오랜 시간과 많은 노동력이 요구되고 있다. 따라서 남성불임을 보이는 남자의 정액샘플에서 좋은 정자만을 효율적으로 선별해 내는 새로운 방법의 개발이 시급하다. 따라서 본 논문에서는 정자의 생물학적 특성인 주화성과 주열성을 이용할 수 있도록 MEMS기술과 마이크로 몰딩 기술로 제작된 활동성 정자 분리를 위한 생체환경 모사 집적화된 마이크로바이오칩 시스템을 제안하고자 한다. 이를 위해 다음 세가지로 나누어 연구를 수행하였다. 첫째, 정자의 주화성을 이용한 운동성 정자의 분리용 마이크로바이오칩을 설계 및 제작하였다. 제작된 마이크로채널 내에서 농도구배가 선형적으로 형성됨을 형광실험을 통하여 확인하였고 유도물질인 아세틸콜린과 대조군으로 사용된 탈이온수를 이용하여 쥐 정자가 채널 내에 형성된 농도 구배에 대하여 주화성 반응을 보이는 것을 확인하였다. 그리고 제작된 마이크로칩 상에서 쥐 정자를 이용하여 유도물질인 아세틸콜린의 농도에 따른 활동성 정자분리 실험을 수행하여 주화성 반응을 일으키는 최적의 농도구배를 도출하였다. 둘째, 주열성에 의한 활동성 정자를 분리하기 위해 마이크로바이오칩과 센서가 내장된 ITO 박막형태의 마이크로히터를 설계하고 상용유체해석 프로그램인 CFD-ACE+를 이용하여 열전달 해석을 수행하여 설계의 타당성을 검증하였다. 설계된 칩과 히터를 제작하고 LabVIEW를 이용하여 제작된 히터와 센서를 통해 마이크로바이오칩의 온도를 제어할 수 있는 온도제어 시스템을 구성하였고 제작된 ITO 박막형 온도 센서의 온도 실험을 통해 온도-저항값 관계가 선형적임을 확인하였다. 구축된 제어시스템을 이용하여 제작된 마이크로바이오칩 내부에서 온도구배가 선형적으로 형성되는 것을 열전대를 이용한 칩 내부온도 측정실험을 통해 확인하였으며 이를 바탕으로 다양한 온도조건으로 마우스 정자의 주열성 실험을 수행하여 마우스 정자가 주열성 반응을 가장 잘 나타내기 위한 조건을 도출하였다. 셋째, 주화성 반응과 주열성 반응이 동시에 유도될 수 있는 생체환경 모사형 집적화된 시스템을 구성하였다. 연구의 효율성을 높이기 위해 주열성 실험에서 사용된 온도제어 시스템과 마이크로바이오칩을 이용하고 여기에 주화성 실험에서 도출된 최적 농도조건을 적용시켰다. 실험을 위해 대조군을 설정하고 여기에 주열성 실험과 주화성 실험을 병행하여 실험결과를 비교 분석하였다.