간내 환경(배지)에 따른 간성상세포 및 간세포 활성 변화에 대한 연구

Abstract

연구배경: 간은 혈액순환이 풍부한 장기로 간문맥과 간동맥에 의해 심박출량의 약 25%를 공급받게 된다. 이 중 간문맥혈류의 변화로 간혈류량을 일정하게 유지하는 간동맥완충반응(hepatic arterial buffer response, HABR)이 있지만, HABR과 간경변증 정도와의 관련성에 대해서는 아직까지 잘 알려져 있지 않다. 간기능은 간세포의 구성 및 충분한 영양소성 혈류에 좌우된다. 간경변증에서는 문맥고혈압과 과도한 내장기관 순환이 특징적으로 발생하며, 이로 인한 간 혈류 조성의 변화는 간내 환경과 이에 따른 간 구성세포들의 반응성 및 활동성에 영향을 미친다. 이 중 가장 특징적인 변화가 간성상세포 (hepatic stellate cell, HSC)의 활성화라고 할 수 있다. 본 연구는 다양한 환경 변화에 따른 간세포와 간성상세포의 기능변화와 간경변증 발생과의 상관성을 규명하기 위한 연구방법을 정립하기 위하여 생체로부터 분리한 간세포와 간성상세포의 최적의 분리와 배양조건을 연구하여 향후 간세포와 간성상세포 활성화를 규명하는 적합한 방법을 제공하려 시도하였다. 연구방법: 흰쥐의 간문맥에 관류액 및 혈액을 통과시키고 간조직을 채취하였다. 이후 간조직의 여과와 원심분리를 통해 간세포와 간성상세포를 분리한 후 우선 0.1μg과 0.5μg 두 가지 농도의 Collagen I를 코팅한 배양판에 alpha-MEM, DMEM, MEM, RPMI, William's E media의 5개의 배지에서 각각 총 114시간까지 간세포를 배양시켜 세포의 viablility를 현미경하에서 관찰하였다. 최적의 배지와 Collagen I를 찾고, 배양조건과 간성상세포 연구에 가장 많이 사용하는 배지와 비교하였다. 또한 간조직에서 직접 채취한 간성상세포를 배양하여, 간성상세포 배양 연구에 충분한 세포수를 얻을 수 있는 방법을 연구하였다. 연구결과: α-MEM, DMEM 배지에서는 0.1μg 농도 코팅배양판에서 viability가 경과시간에 비례적으로 감소하여 114시간 후에는 10%이하가 되었으며, 0.5μg의 농도 코팅배양판에서는 큰 변화가 없었다. MEM, RPMI배지에서는 농도에 관계없이 배양 114시간까지 경과시간에 비례적으로 감소하여 각각 20%이하, 30%이하의 viability를 보였다. William's E 배지는 114시간까지 경과시간에 비례적으로 viability가 감소하였으나 0.5 μg의 농도에서 60%가 유지되었다. 따라서 William's E 배지를 최적 배양조건으로 결정하였고 배양액의 산도에 따른 배양상태에서는 pH 7.2에서 가장 배양상태가 우수하였다. 또한 간성상세포 배양실험에서도 0.5μg Collagen I 코팅배양판에서 가장 일반적인 배양액인 10% DMEM과 본 연구에서 선택한 10% William's E 배지에 간세포와 간성상세포를 분리하여 각각 두 배지에서 배양한 결과, 간세포와 간성상세포 모두가 William's E 배지에서 배양상태가 우수하였고 배양 8일째에 간성상세포의 수가 증식하여 충분한 수를 얻을 수 있었으며, 1 계대배양에서도 10% William's E 배지에서의 배양상태가 우수하였다. 그러나 간세포 배양에서 확인한 William's E 배지에 dexamethasone을 첨가한 효과가 간성상세포에서는 별다른 효과를 얻을 수 없어서, 간세포와 간성상세포에는 0.5μg Collagen I 코팅배양판에서 10% William's E 배지가 가장 적합한 배지이며 배지의 pH도 7.2가 가장 적합한 배양조건이었다. 결론: 이상의 결과로 미루어보아 간세포와 간성상세포 연구에서 가장 적합한 배양판과 배지는 0.5 μg Collagen I 코팅 배양판에서 기존의 10% DMEM 배지보다는 10% William's E 배지가 가장 적합하였으며 배양속도는 배양 8일째 세포연구에 충분한 수의 세포를 확보할 수 있었다. 또한 배지의 pH도 7.2가 가장 적합함을 알 수 있었다. 그러므로 본 연구결과를 근거로 기존의 간세포와 간성상세포주를 이용한 실험과 기존의 배지의 한계를 극복하여 간세포와 간성상세포를 활용한 연구의 효율성을 향상시킬 수 있는 방법을 제시하였다.; Background and purposes: The blood flow of liver is supplied about 25% of cardiac output by portal vein and hepatic arteries. Hepatic arterial buffer response (HABR) is an intrinsic regulatory mechanism of the liver to maintain total hepatic blood flow when portal perfusion decreases, but it is not clear whether HABR is preserved in patients with cirrhosis and whether it is dependent on the stage of liver disease. The liver function is mediated by composition of hepatic cells and adequate blood supplmentation. In cirrhosis, altered hemodynamics, such as portal hypertension and increased hepatic artery flow crucially deteriorate tissue oxygenation and liver function, and have an effect on activity in hepatic cells. The most characteristic change of hepatic cell is the activation of hepatic stellate cells in liver cirrhosis. In this study, we suggest an effective protocol for isolation and culturing of hepatocyte and hepatic stellate cell, and investigate the best condition for culturing and viablility to establish the study methods for proving correlation between the change of function in hepatic stellate cell and liver cirrhosis. Materials and methods: Sprague-Dawley rat liver was perfused through portal vein catheter with perfusate and blood, and removed from body cavity. Hepatocytes and hepatic stellate cells were isolated from liver tissue by filtering and density gradient centrifugation, and seeded in with an alpha-MEM, DMEM, MEM, RPMI, and William's E media containing collagen I with 0.1μg or 0.5μg density. We observed the cell viability in each media under the microscope until 114 hours after culture. After finding out the optimal media and density of collagen I, we compared the yield and viability of hepatocytes and hepatic stellate cells with that of conventional media and also studied the effective method to obtain enough number of hepatic stellate cells in primary cell culture. Results : In α-MEM, DMEM media, the viability of hepatocytes was decreased in proportion to culture time, so the percentage of viability was below 10% after 114 hours in coated culture plate containing collagen I with 0.1μg density, but wasn't changed in coated culture plate with 0.5μg density. In MEM, RPMI media, the viability was also decreased in proportion to culture time, so was below 20%, 30% respectively, but there was no relationship between viability and density of culture media. In William's E media, the viability was maintained about 60% in 0.5 μg density after 114 hours of culture, therefore we decided William's E media upon the best condition for culturing. When we changed the pH in culture media, the viability was superior in pH 7.2 to any other pH. In the culture of hepatic stellate cells, the best condition was 10% Williams E media on the coated culture plate containing collagen I with 0.5μg density. After 8 days of culture, the number of hepatic stellate cell became was increased enough for study, and the status of 1st subculture was most excellent in 10% William's E media. Conclusion: The best condition for study of hepatocytes and hepatic stellate cells was 10% Williams E media on the coated culture plate with 0.5μg density, and the status of culture was most excellent in pH7.2 after 8 days of culture. We report the more effective method for the studies using hepatocyte and hepatic stellate cells than conventional method using cell lines. Further studies about the most adequate environment for cell viability and proliferation will be needed.