배양된 기관형적 해마 절편에서 NGF의 신경 반응에 대한 연구

Abstract

In vitro 환경에서 In vivo와 가장 가까운 실험 환경을 만들기 위해서 7일된 SD(Sprague-Dawley) rat의 해마를 절편하여, CO₂ incubator를 사용하여 배양하였다. 2주간 배양된 해마 (Hippocam pus)를, PI staining을 통해 상태가 양호한 조직만을 선택적으로 실험에 사용하였다. 실험에 사용한 물질은 신경영양물질의 일종인 NGF(nerve growth factor)이고, 배양된 해마가 아닌 다른 종류의 세포와 뇌의 다른 영역에서 NGF로 인한 신경활동성 증가에 대한 보고가 있었다. NGF 농도는 50 ng/ml, 100 ng/ml, 200 ng/ml에 따라 신경활동성 증가가 나타났다. 그렇지만 안정된 결과는 고농도에서 얻을 수 있어 200 ng/ml의 농도로 실험을 진행하였다. 일반적으로 NGF는 Trka 와 p75 두 수용체에 작용하는 것으로 알려져 있고, 뇌의 부위에 따라 두 수용체 발현 정도가 다르다고 알려져 있다. 또한, 일반적으로 Trka를 통한 NGF의 효과가 크게 나타난다[6]. 이 연구에서는 NGF 를 투여하였을 경우에는 신경활동의 큰 증가가 일어났다. 그 후 wash out 후에도 LTP(Long Term Potentiation)-like한 시냅스 강화가 일어났다. Trk 수용체 멤버들의 Blocker인 K252a 사용하였을 경우에도 신경활동 증가가 약간 감소하기는 하였으나, 완전히 막지는 못하였고, p75 antibody를 사용하여, p75 수용체를 Block하였을 경우에는 신경활동 증가가 보이지 않는 결과를 얻을 수 있었다. 일반적인 결과와는 사뭇 다를 수 있는 결과이나, 뇌의 특정 부위에서는 p75를 통하여 NGF효과가 나타나는 결과도 있어, 그와 같은 맥락으로 생각 할 수 있다[6][7][8]. 특히, p75를 Block 했을 때, 더 많은 세포 사멸을 관찰 할 수 있다는 보고도 있었다[5]. 이는, p75가 세포의 생존에 굉장히 중요한 역할을 한다는 것으로 볼 수 있고, 전기 생리학적으로도 NGF가 p75를 통하여 신경활동성을 증가시켜 세포의 생존을 위한 신호전달을 하는 것으로 볼 수 있다. 다시 말해서, Trk 수용체 억제제인 k252a를 처리한 경우에는 NGF 처리 시간 동안 나타났던 neuronal activity 증가는 막지 못하였으나, wash후의 시냅스 강화에 의한 효과는 억제하는 것을 관찰할 수 있었다. 이것은 선행된 다른 연구들에서 k252a가 LTP 유도를 억제한다거나 synaptic activity를 억제한다는 결과들로 미루어 볼 때 NGF에 의한 LTP-like한 효과를 억제한 것으로 보인다[32]. 또한 k252a는 TrkA receptor뿐만 아니라 다른 Trk receptor family 모두와 작용을 하기 때문에 다른 Trk member에게도 영향을 준 것으로 생각된다. 반면에 p75 antibody를 처리한 경우에는, 이것이 p75 수용체를 block함으로써 NGF에 의한 neuronal activity 증가와 LTP-like한 효과를 모두 억제하는 것으로 관찰되었다. In vitro 환경에서 배양된 기관 형성적 해마절편을 사용하여, In vivo와 거의 유사한 배양된 조직을 이용하였다. 그 후 신경영양물질에 대한 특히, 세포의 사멸과 생존에 관련된 물질인 NGF에 대한 실험을 진행하였다. 특히, 기관 형성적 해마절편의 배양 후에는 NGF의 작용이 p75를 통해서 좀 더 강하게 modulation되는 결과를 얻을 수 있었다.[10] 그리고 LTP-like한 작용에서는 Trk family receptor들이 중요하게 작용하는 것으로 보인다.; Nerve growth factor (NGF), the first discovered protein of the neurotrophins, is required for the survival and development of neuronal cells by binding specifically TrkA and p75 neurotrophin receptor. It is well established to have neurotrophic effects on basal forebrain cholinergic neurons, but its potential actions as a fast-acting neuromodulator are not as well understood, especially in the cultured rat organotypic hippocampal slice. In the present study, we investigated that effect of NGF and spatiotemporal change of the effect on neuronal activity in rat organotypic cultured hippocampal slice using MEA system. Here we show that NGF rapidly increased the fEPSP activity like LTP form and NGF-induced activity increment occurred even in the presence of the Trk receptor blocker K252a but not p75 receptor antibody. In other words, these results show that K252a may block NGF-mediated LTP-like effect. In contrast with, when treated NGF together with anti-p75 antibody, it was completely inhibited both NGF-induced neuronal activity increase. Taken together, these results demonstrate that NGF-mediated LTP-like effect may mediate two receptors by a different manner in cultured organotypic hippocampal slice.