EPO 유전자를 형질도입시킨 인간 중간엽기질세포의 세포보호 및 신경영향인자 발현증가 효과

Abstract

인간의 성체줄기세포는 다양한 조직으로 분화 가능하며 골수에서 쉽게 분리할 수 있다. 이러한 점을 이용하여 최근에는 치료유전자를 형질도입하여 다양한 질환모델에서 연구가 활발히 진행되고 있다. 재조합된 EPO는 신경보호효과와 세포보호효과의 특성을 가지고 있어 다양한 손상조건과 동물질환 모델에서 보호효과가 입증되었다. 이러한 EPO를 성체줄기세포에 형질도입하여 상호작용 효과를 확인하고자 하였다. 본 실험을 위해, EPO유전자를 형질도입 시킨 성체줄기세포와 본래의 성체줄기세포의 특성을 FACS로 확인하였다. EPO유전자가 형질도입 된 성체줄기세포에서 성공적인 형질도입과 그에 따른 EPO의 발현 여부를 확인하기 위해 MOI(multiplicity of infection)별로 형질도입하여 EPO 발현 양을 western blotting과 ELISA로 확인하였다. EPO유전자를 형질도입 시킨 성체줄기세포와 외부에서 처리한 EPO에서 세포보호효과를 확인하기 위해서 산화성 손상으로 H₂O₂와 세포사멸을 유도하는 staruosporine을 처리하여 MTT assay로 확인하였다. EPO유전자를 형질도입 시킨 성체줄기세포의 세포보호효과의 메커니즘을 확인하기 위해 real-time PCR로 BDNF, VEGF, bFGF-2 and SDF-1α. 신경영향인자의 발현 정도를 확인하였다. 이러한 실험을 통해 EPO유전자를 형질도입 시킨 성체줄기세포는 본래의 성체줄기세포의 특성을 잘 유지하고 있으며, 10units/ml로 생산됨을 확인하였다. EPO유전자를 형질도입 시킨 성체줄기세포가 H₂O₂와 staruosporine에 의해 유도된 손상에서 rhEPO를 외부에서 처리한 성체줄기세포에서 보다 세포보호효과가 있음을 확인하였다. 또한 배양된 상층액을 이용하여 확인한 신경보호효과에서도 EPO유전자를 형질도입 시킨 성체줄기세포가 더 보호효과가 있음을 확인하였다. Real-time PCR로 BDNF, VEGF bFGF-2 and SDF-1α. 의 신경영향인자발현 정도를 확인한 결과 rhEPO를 외부에서 처리(10units/ml)된 성체줄기세포에서 보다 EPO유전자를 형질도입 시킨 성체줄기세포에서 발현량이 증가함을 확인하였다. EPO유전자를 형질도입 시킨 성체줄기세포가 rhEPO를 외부에서 처리된 성체줄기세포에서 보다 더 세포보호효과가 있는 것을 확인하였고, 신경영향인자의 발현이 증가하는 점을 이용하여 동물질환모델에서 세포치료를 위한 접근가능성을 제시하고 있다.; Bone marrow human mesenchymal stromal cells (BM-hMSCs) could differentiate into various tissue and be easy to prepare from adult bone marrow. Recently, previous studies have provided the evidences that BM-hMSCs could be employed as delivery vehicles following the incorporation of therapeutic genes. Human erythropoietin (hEPO) has been emerged as neurotrophic, anti-oxidant, anti-apoptotic, and anti-inflammatory factors. In this study, BM-hMSCs was transduced with hEPO gene through lentiviral vector and it was evaluated whether EPO-transduced MSCs (EPO-hMSCs) contribute cytoprotective effects in cell based system. EPO-hMSCs produced rhEPO 10unit/ml/day without any alteration of mesenchymal phenotypes which are confirmed western blotting, ELISA, and FACS analysis. When compared with viability of exogenously 10U rhEPO treated hMSCs against the H₂O₂-induced oxidative stress or staurosporine-induced apoptosis, that of EPO-hMSCs was increased. Real-time PCR and western blot data revealed that rhEPO enhances secretion of neurotrophic factors including VEGF, BDNF, bFGF-2 and SDF-1α. We also found that this increase is higher in EPO-hMSCs than in 10U-EPO. These finding suggest that hMSCs with EPO gene may reveal more potent synergistic effect than exogenous EPO treatment into hMSCs. When compared with 10U-EPO, endogenous expression of EPO-hMSCs can synergistic effects such as the effects of cytoprotection and production of neurotrophic factors. Taken all together, these data suggest that EPO-hMSCs might be good candidate for cell therapy in the model of ischemic and neurodegenerative diseases.