NMR을 이용한 3,5-dibromo-2 Pyrone의 Diels-Alder Cycloadducts 및 항생제 구조 연구

Abstract

Part Ⅰ. NMR을 이용한 3,5-dibromo-2 Pyrone의 Diels-Alder Cycloadducts의 입체이성질체 구조 연구 균류에 존재하는 천연물 Rapiculine 합성을 위해 3,5-dibromo-2 pyrone의 inter- 그리고 intramolecular Diels-Alder cycloaddition으로부터 얻은 Bicyclolactone을 NaOMe, MeOH 조건과 MOMCl, DIPEA, CH2Cl2 조건하에서 반응시켰다. 합성결과 얻어진 생성물은 세 개의 입체이성질체로 존재하였고, Rapiculine 합성을 위한 선택적인 입체구조물질을 얻기 위해 세 가지 입체이성질체를 NMR을 이용하여 분석하였다. 본 연구에서는 ¹H-NMR, HSQC, COSY, TOCSY, NOESY, ROESY를 이용하여 각각의 입체이성질체에 대한 NMR 시그널을 지정하였다. Diastereomer Ⅰ의 경우 NOESY 스펙트럼에서 49번 수소와 50번 수소의 강한 NOE intensity를 확인하였으나 나머지 두 개의 입체이성질체는 49번 수소와 50번 수소의 약한 NOE intensity를 확인하였다. 또한 Diastereomer Ⅲ의 경우 ¹H NMR data에서 45번 수소와 49번 수소 peak들이 overlap 되어 있음을 확인하였다. NOESY 스펙트럼에서 얻은 NOE 신호를 바탕으로 수소들 간의 거리 정보를 얻었고 이를 바탕으로 distance geometry(DG)와 molecular dynamics(MD)를 수행하여 3차원 구조를 결정하였다. DG 구조가 실험적인 NOE 정보와 일치하는 가를 알아보기 위해 2D-NOESY 역 계산을 수행하여 계산된 스펙트럼과 실험된 스펙트럼을 비교하였다. 두 스펙트럼이 정확하게 일치하는 3차원 구조 결정을 위해 실험 데이터 재확인 및 수정 과정을 거쳤다. 이와 같은 NMR 스펙트럼 시그널 해석 결과와 2D-NOESY 역 계산 수행 결과를 바탕으로 세 가지 입체이성질체가 각각 Diastereomer Ⅰ-C_(13)(R), C_(14)(S), C_(5)(S), Diastereomer Ⅱ-C_(13)(S), C_(14)(S), C_(5)(R), Diastereomer Ⅲ-C_(13)(R), C_(14)(S), C5(R)의 Chiral center를 갖는 3차원 구조로 규명하였다. Part Ⅱ. 제약용 항생제의 분리정제 및 NMR을 이용한 물질 확인 연구 제약용 항생제는 여러 성분으로 구성된 복합제제로 보존제나 용해제, 또는 복합 항생제로 품질 정량시험을 할 때 특정한 성분만 선택적으로 분석하기 위해서 적절한 분리정제 시험방법 확립이 필요하다. 본 연구에서는 제약용 항생제 분리정제 시험법을 개발하고, 그 시험법에 따라 시험한 물질 확인 연구를 수행하였다. 제약용 항생제로 Trimethoprim, Sulfamethazine, Enrofloxacin, Apramycin 제제를 사용하였으며 정량시험 방법으로는 고속액체크로마토그래피를 사용하여 각각의 표준물질과 비교 분석하여 함량 및 확인시험을 실시하고 HPLC분석에 따른 물질을 ¹H-NMR, ^(13)C-NMR, DEPT, COSY, TOCSY, HSQC 실험을 통해 신호 분석을 실시하였다. HPLC 실험 결과 모든 시험시료의 Retention Time이 각각의 Standard Retention Time과 일치 하였으며, 각 성분의 함량 또한 100%에 가까운 것으로 확인되었다. 또한, 이렇게 분리 정제된 시료를 ¹H-NMR, ^(13)C-NMR, DEPT, COSY, TOCSY, HSQC로 측정하여 신호분석을 확인하고 ESI-Mass spectrum을 통해 분자량을 확인한 결과, 실험시료 모두 각각의 Standard와 같은 항생 물질임을 확인하였다.; Part Ⅰ. Structural Study of Diastereomers Ⅰ Resulted from Diels-Alder Cycloaddition of 3,5-dibromo-2 Pyrone by NMR Bicyclolactone obtained by inter- and intramolecular cycloaddition of 3,5-dibromo-2 pyrone was reacted under NaOMe, MeOH and MOMCl, DPIEA, CH₂Cl₂ conditions to synthesize natural product which exists in fungi. The reactions produced three different stereoisomers, and absolute stereochemistries of these products were unambiguosly determined by using 2D NMR experiments and 2D-NOE backcalculation methods. In this study, the NMR signal assignments of each isomer was completely accomplished with COSY, TOCSY, NOESY and ROESY. Distance of numerous protons were obtained based on the NOE cross peak intensities of NOESY spectrum. On the basis of these distance data, distance geometry(DG) and molecular dynamics(MD) were carried out to determine the structures of isomers. NMR spectral comparisons of three diastereomers were made. H_(_(45)), H_(_(49)), H_(50) peaks of three chiral center were analyzed in NOESY spectrum. Strong intensity of direct NOE contact from H_(_(49)) to H_(50) was observed for the diastereomer Ⅰ form. In the case of diastereomer Ⅱ form, strong intensity of direct NOE contact from H_(45) to H_(49) was observed. Otherwise, 1H-NMR signal overlap was severe so that the direct NOE contact from H_(49) to H50 could not be resolved very well in the diastereomer Ⅲ form, but medium intensity of direct NOE contact from H_(45) to H50 was observed. As a result, the structures of three diastereomers according to position change of the three chiral center hydrogens were identified to be C_(13)(R), C_(14)(S), C_(5)(S) for stereoisomer Ⅰ, to be C_(13)(S), C_(14)(S), C_(5)(R) for stereoisomer Ⅱ, and to be C_(13)(R), C_(14)(S), _(5)(R) for stereoisomer Ⅲ, respectively. Part Ⅱ. Purity Identification of selected antibiotics by NMR Antibiotics used in medicines are composed of various ingredients. For the QA/QC of these medicines, it is necessary to establish an appropriate separation method in the analysis of specific ingredient. In this study, the newly developed method of antibiotics for medicines was carried out in identification of medicines. A tablet containing Apramycin, Enrofloxacin, Sulfamethazine and Trimethoprim as an antibiotics were used. Assay and identification tests were made and compared with the standard of each material by the HPLC and ESI-Mass. Experimental HPLC conditions for antibiotics were independently set up and compared with those of standard samples. Materials separated and purified with HPLC were then characterized by 1H, ^(13)C-NMR, DEPT, COSY, TOCSY and HSQC NMR spectroscopy. In addition, the purity identifications of each sample are accomplished by the complete NMR signal assignments.