ApoB-100 특이 항체에 의한 비만치료의 대사적 특성

Abstract

비만은 대사성 질환으로 그 치료와 예방에 있어 많은 노력과 사회적 비용이 소요되고 있다. 비만이란 음식으로 섭취한 에너지원이 체내에서 소모되고 남는 잉여분이 축적됨으로 발생한다. 특히 지방은 소장에서 흡수되어 chyromicron의 형태로 순환하며 간으로 이동하여 apoB, apoE 등이 결합된 VLDL의 형태로 재구성된다. 혈액내의 VLDL은 lipoprotein lipase에 의해 가수분해되어 IDL, LDL이 되어 말초조직으로 흡수된다. 선행연구에서 ApoB-100의 구조를 모방한 mimetic peptide pB1을 작성하였다. 이 peptide를 실험동물에 면역주사하면 유도되는 anti-pB1 antibody는 LDL이나 VLDL에 있는 apoB와 결합하여 이들의 수용체에 대한 결합을 저해하여 조직으로의 흡수와 축적을 저해하여 비만치료제로서의 기능을 하는 것으로 확인되었다. 본 연구에서 백신으로 유도된 Apo B-100특이 항체가 VLDL의 apoB-100을 인식하여 Lipoprotein-항체 착물(complex)이 되었을 때 나타나는 비만을 억제하는 현상에 대하여 대사적인 특성을 규명하고자 하였다. 첫 번째로 ICR mouse에 B4RB2 백신을 접종하여 비만억제효과가 나타나는 B4RB2의 최소투여 용량을 결정하였으며, 고지방식을 투여하였을 때 혈중 및 stool의 지방농도를 분석하여 지방조직에 축적되지 않은 잉여 지방의 대사경로를 추정하였다. 두 번째로 형광세포분석(FACS)기법을 이용하여 VLDL-항체 착물의 macrophage-uptake에 대한특성을 in vitro실험으로 검토하였다. 그 결과 최소유효용량은 0.6 ㎎/㎏ BW임을 확인하였다. 또한 백신을 50 ㎍을 주사한 실험군에서 항체가 유도되기 전 혈청 중의 total-cholesterol의 농도는 185.4 ± 18.7 ㎎/㎗, LDL-CHO은 63.1 ± 7.5 ㎎/㎗, HDL-CHO는 145.5 ± 0.6 ㎎/㎗, TG는 85.4 ± 37.1 ㎎/㎗에서 항체가 유도된 후 농도는 각각 306.3 ± 28.4, 109.1 ± 15.7, 177.6 ± 4.6, 102.7 ± 41.6 ㎎/㎗로 20~70% 증가하였다. 반면, stool에서의 지방함량은 항체 유도 전 38.0 ± 4.0 uM/g 에서 36.0 ± 1.0 uM/g로 큰 차이는 보이지 않았다. 또한 In vitro 실험에서 raw 264.7 cell에 VLDL, VLDL-항체 착물, oxVLDL, oxVLDL-항체착물을 처리한지 24시간이 경과한 후 세포에 탐식된 정도가 control에 비해 45, 300, 150 및 87배로 증가하였으며, 세포의 활성도 역시 1.5, 1.7, 1.2 및 2배로 증가하였다. 48시간이 경과한 후의 세포로 탐식된 정도는 10, 200, 48 및 50배로 24시간에 비해 감소하였으나 세포의 활성은 각각 1.2, 1.8, 1 및 2배로 그대로 유지되고 있음을 알 수 있었다. LDL 혹은 VLDL을 탐식한 macrophage에 있어서 cholesterol의 처리과정은 동맥경화 발생과 관련하여 많은 연구 보고가 이루어 졌으나 지방산에 대한 연구는 전혀 보고된 바가 없다. 따라서 대식세포 내에서의 유리 지방산 혹은 triacylglycerides에 관한 대사에 관한 연구가 이루어 져야 할 것이다. 이상의 결과로부터 B4RB2의 접종으로 비만을 억제한 경우, 섭취한 잉여의 지방은 HDL에 의한 reverse transport와 같은 경로를 통한 배설 경로를 통해 직접 배출되지는 않으며, 말초 지방조직에의 저장이 저해를 받는 만큼, 혈중 잔존 시간은 항체 결합에 의해 연장되는 것으로 나타났다. 혈관 수송계를 이탈하여 내막(intima)으로 이동한 VLDL은 활성화된 조직의 macrophage에 의해 탐식되며, 이와 같이 지방을 포획한 macrophage는 장시간 granule의 증가를 보여 지속적으로 활성화가 유지되고 있음을 확인하였다.; Obesity is a pathologic expansion of body fat depots due to a chronic surplus of dietary lipids and carbohydrates. Obesity is a major risk factor in the development of diabetes and cardiovascular disease, and its prevalence is increasing in many countries including Korea. So far, an effective preventive or therapeutic strategy suitable for the average obesity patient has remained elusive. It is therefore of great interest that our laboratory recently developed an immunological anti-obesity approach that, based on our preclinical studies in mice, appears promising. In this approach, control mice are fed ad libitum a high-fat diet (HFD) that leads to obesity, while experimental mice receive a combination of the diet and a vaccination with a peptide (pB1) that mimics an epitope of the C-terminal part of Apo-lipoprotein B-100 (ApoB-100). Our laboratory found that vaccination with pB1 or its optimized antigenic form, B4RB2, raises antibodies that bind to native Apo B-100 of Very Low Density Lipoprotein (VLDL) and Low Density Lipoprotein (LDL) particles, inhibits the uptake of dietary lipids by peripheral tissues, and prevents obesity. Although we do not yet fully understand how the anti Apo B-100 antibodies affect body weight, it is well known that Apo B-100-containing lipoproteins (VLDL, IDL, LDL) play a central role in the circulation and final deposition of lipids. In the present study, I investigated the effects of B4RB2 on selected lipid-metabolic and immunological parameters in an attempt to further optimize and understand our anti-obesity approach. Firstly, I determined minimal dosage of B4RB2 vaccine that is required for the vaccine to keep ICR mice from being obsessed. Secondly, I traced the fate of VLDL lipids in blood and stools. Thirdly, I used FACS analysis to compare the uptake of VLDL-antibody complexes with that of VLDL and LDL by macrophages in vitro. It was found that the minimal effective injection dosage of B4RB2 was 0.6 ㎎/㎏ body weight, or 20ug/mouse for preventing of body weight increment. Before vaccination, serum concentrations were 185.4 ± 18.7 ㎎/㎗ for total-cholesterol, 63.1 ± 7.5 ㎎/㎗ for LDL-CHO, 145.5 ± 0.6 ㎎/㎗ for HDL-CHO, and 85.4 ± 37.1 ㎎/㎗ for TG. After vaccination with 50 ㎍, these concentrations increased by 20~70% to 306.3 ± 28.4, 109.1 ± 15.7, 177.6 ± 4.6 and 102.7 ± 41.6 ㎎/㎗, respectively. In contrast, the lipid content of stool was unchanged (38.0 ± 4.0 uM/g to 36.0 ± 1.0 uM/g). Compared to control incubations for 24 hr, endocytosis of VLDL, VLDL-Ab, oxVLDL, and oxVLDL-Ab was increased about 45, 300, 150, and 87 fold, respectively, and the level of activation was also increased as 1.5, 1.7, 1.2, 2 folds. After 24 hr more, endocytosis levels decreased slightly to 10, 200, 48, 50 fold, but the activation levels were maintained. Previously, cholesterol treatment pathway of endocytosis of LDL or VLDL was studied in connection with genesis of atherosclerosis, however, there was no studied about fatty acid. So, the research about metabolic pathway in macrophages of free fatty acid or triacylglycerides should be accomplished. In conclusion, following vaccination with B4RB2, excessive dietary fat was not directly eliminated through the intestines, but its absorption by peripheral tissues was inhibited. These results suggest that VLDL that moved into the intima were endocytosed by macrophages, and lipid-accumulated macrophage maintained the activity continuously.