한국산 무당개구리의 성 분화 조절

Abstract

양서류의 성염색체는 크게 수컷이형접합 (XY/XX)과 암컷이형접합 (ZW/ZZ)로 나누어진다. 염색체의 성적이형 현상과 더불어 환경적 요인과 호르몬의 작용이 외적 성결정 및 성역전 현상에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 한국 토종 무미양서류의 일종인 무당개구리 (Bombina orientalis)는 XY/XX type에 속하며, 호르몬에 의해 성역전이 일어나지 않는 것으로 보고되었다. 양서류 성적이형은 유생시기를 지나 변태과정에서 나타나며, 이 시기에 간중배엽 (intermediate mesoderm)에서 기원한 양측성생식소 (bipotential gonad)가 정소 (testis)와 난소 (ovary)로 분화한다. 정소분화에는 성결정유전자 (sex-determining gene, Sry)가 중심적 역할을 하며, autosomal Sry-related HMG box gene 9 (Sox9) 역시 직접적으로 관여한다. 또한, Sox3, SF1, WT1, Wnt4, Dmrt1, Dax1, Fgf9, GATA4 유전자 등이 관여한다. 본 연구에서는 한국산 무당개구리의 생식소 분화과정을 규명하고자, 변태과정에서 생식소의 형태적 발달과정을 정리하고, 이에 관여하는 Sox9, Sox3, SF1, WT1, Wnt4, Dmrt1, Dax1, Fgf9, GATA4 mRNA 염기서열 규명과, 분화중인 생식소에서 이들의 발현을 분석하였다. 또한 PCR sexing 기법을 개발하였다. 연구결과, 무당개구리에서 생식소의 성분화는 변태 33단계에 이르러 개시되며, 정소와 난소 특이적인 조직학적 특징이 나타남을 알 수 있었다. 생식소의 성적 분화가 일어나지 않은 배아 또는 유생의 성별을 확인하기 위해 2개의 유전자를 이용한 PCR sexing 결과는 생식소의 조직학적 성분화 특성과 각각 70, 80%의 일치도를 보였지만, 두 결과가 일치하는 개체에서는 조직학적 특성과 100% 일치하였다. SF1, GATA4, WT1+KTS, WT1-KTS 유전자가 변태 초기에 다량 발현되었으며, 특히 WT1-KTS를 제외한 유전자들은 수컷에서 다량 발현되었으며, WT1-KTS는 암컷에서 높게 발현되었다. 따라서 WT1-KTS 단백질은 난소분화 조절기능을 갖는 것으로 사료된다. Sox9은 수컷에서 많이 발현되었고, 변태 종료시점에 가장 많이 발현되었다. Fgf9은 생식소 분화 이전단계의 수컷 생식소에서 발현양이 높았다. Sox3는 생식소분화 초기단계의 암수 생식소에서 모두 발현되었고, 변태 이후에는 암컷 생식소에서 다량 발현되었다. Dax1은 다른 유전자들과는 달리 변태 중기 수컷 생식소에서 발현되었고, Dmrt1은 변태종료 후 암컷에서 다량 발현되었는데, 기존에 보고된 기능과 부합하지 않으므로, 무당개구리에서 새로운 성분화 조절기능을 갖는 isotype일 가능성이 있다. 한국산 양서류인 무당개구리 생식소분화 조절 유전자의 특성과 생식소의 형태분화에 대한 결과들은 양서류 성분화기작에 대한 분자생물학적 이해 뿐 아니라 내분비계장애물질 등 환경요인에 의한 양서류 성교란 현상 연구에 이용될 수 있을 것이다.; In amphibians, although sex chromosomes are responsible for sex determination with either male heterogamety (XY/XX) or female heterogamety (ZW/ZZ), the environmental factors and hormones can override the genotypic mechanism of sex determination and induce sex reversal. But, the fire-bellied toad (Bombina orientalis) which belongs to male heterogamety group is refractory to sex hormone in external sex determination. In amphibians, testis or ovary develops during metamorphosis from bipotential gonad of intermediate mesoderm origin. Sex-determining gene (Sry) has central role in testis development and autosomal Sry-related HMG box gene 9 (Sox9) also directly participates in testis determination. Transcription factors including Sox3, SF1, WT1, Wnt4, Dmrt1, Dax1, Fgf9 and GATA4 also involved in gonad differentiation. In an effort to elucidate the genetic regulation of sex differentiation in Korean B. orientalis, cDNA sequences for Sox9, Sox3, SF1, WT1, Wnt4, Dmrt1, Dax1, Fgf9, and GATA4 that participate in gonad development were determined. Furthermore, the expression of above genes during metamorphosis was analyzed together with morphological analysis of gonad differentiation. Finally, PCR sexing was conducted to verify the gonadal sex coincided with the genetic sex in tadpoles. Sex differentiation started in B. orientalis at stage 32-33 and thereafter female gonad was divided into medulla and cortex region. Although two different PCR sexing methods resulted in 70~80% identity with gonadal morphology, corresponding cases in two PCR results were the same, showed high accuracy (100%) with gonal morphology. Realtime PCR revealed that SF1, GATA4, WT1+KTS, and WT1-KTS mRNA levels were high level during pre-metamorphic stage. They are highly expressed in male gonad excepting WT1-KTS which is highly expressed in developing ovary, suggesting WT1-KTS functions in ovary development in B. orientalis. Sox9 mRNA were largely found in male gonad and reach to the highest level in metamorphosis complete stage. Fgf9 mRNA were appeared in male gonad before sex determination. Sox3 mRNA was found in both sex before sex determination and the highest in ovary at post-metamorphic stage. Dax1 mRNA was appeared in male gonad at mid-metamorphic stage. Dmrt1 mRNA was detected in ovary at post-metamorpic stage. This expression patterns of Dmrt1 and Dax1 mRNA was not coincided with their formerly reported functions, suggesting that they are the Dmrt1 and Dax1 isotypes having unique role in gonad development in B. orientalis. This is the first report on the characteristics of genes involved in the development of gonad in Korean amphibian species. Together with the morphological feature of gonad development, molecular information obtained from B. orientalis will be helpful for the understanding the sex-reversal by environmental factors and endocrine disruptors as well as molecular mechanism for gonadal development in this Korean amphibian species.