Negative Regulation of Estrogen Receptor Alpha transcriptional Activity by p27

Abstract

ERα는 세포증식과 생존에 관련된 유전자의 발현을 조절하며, 유전자의 전사활성에 영향을 미친다. ERα의 리간드-수용체 복합체의 형성은 수용체 단백질의 입체구조의 변화를 유발하게 되고 활성화시킨다. 활성화된 ERα는 세포핵으로 이동하여 유전자 전사조절 부위에 결합하고 유전자 발현 및 세포분열, 단백질 합성에 관여하여 조직의 분화 및 성장에 직접적인 영향을 미친다. 또한 다른 DNA 결합 전사인자와 상호 작용하여 간접적인 전사활성에도 영향을 미친다. p27은 G1기에 있는 세포나 transforming growth factor(TGF)-β 처치를 한 세포에서 음성 성장 조절자의 역할을 하는 것으로 알려지기 시작하였으며, 세포 분열에 관여하는 사이클린-의존성 키나아제(cyclindependent kinase; CDK)의 활성과 cyclin-cdk복합체들, 즉 cyclin D-cdk4, cyclin E-cdk2, cyclin A-cdk2들에 부착하여 이들의 작용을 억제함으로써 세포의 비정상적인 성장을 억제하는 것으로 알려져 있다. 우리는 ERα에 의해서 일어나는 전사능에 p27이 어떠한 영향을 끼치는지 알아보고자 했다. 우리는 p27의 발현에 따른 ERα의 전사 능력을 알아보기 위하여 MCF7 세포주에 shRNA를 이용하여 MCF7 세포 내에서의 p27의 발현을 억제시켰다. 우리는 MCF7세포 내에서 p27의 발현이 억제가 되면 E2에 의한 ERα에 의한 전사 능력이 p27이 발현하는 세포보다 높아지는 것을 유전자 발현 분석을 통해 알 수 있었다. 반면 293T 세포주를 대상으로 p27과 ERα을 형질 도입 실험을 한 결과, p27이 세포주 내에서 과발현이 되게 되면 ER에 의한 전사 능력이 감소 되는 것을 알 수 있었다. p27이 특이적으로 ERα의 전사능력을 조절 하는지 그렇지 않으면 세포주기의 조절때문인지 확실히 알아보기 위하여 다른 전사능력을 가진 NFĸB와 TOPFLASH 인자들을 293T 세포주에 p27과 함께 형질도입하여 유전자발현 분석을 통해 알아보았다. 그러나 p27이 아무런 영향을 끼치지 못한다는 것을 알 수 있었다. 또한 p27이 특이적으로 ERα의 전사 조절 능력을 감소시키는 것이 ERα 단백질이 핵 안으로 들어가는 것을 억제하는 것을 면역 형광염색과 세포 분획법을 통해 알 수 있었다. 상호 면역 침전법을 통하여 ERα의 전사 능력을 도와주는 보조인자인 cyclin D1과 p27이 복합체를 이루어 cyclin D가 ERα의 보조인자로써의 역할을 수행하지 못하게 하는 것을 알았다.; Estrogen receptor α (ER α) is a DNA binding transcription factor which regulates reproductive function and transcription of its target genes. A member of cip/kip family of cyclin-dependent kinase inhibitors, p27 is responsible for cell cycle arrest at G1 stage. To investigate the effect of p27 on ER-mediated transcription, we generated p27 knock-out MCF-7 breast cancer cells (MCF-7 hp27shRNA) via retroviral delivery of p27 shRNA. Knock-down of p27 in MCF-7 cells resulted in up-regulation of ER-mediated transcription by estradiol as compared to control MCF-7 cells (MCF-7 mp27shRNA). Accordingly, transient transfection studies revealed that overexpression of p27 in 293T cells reduced ER-mediated transcription. It appears that the effect of p27 on ER transcriptional activity is independent from cell cycle arrest by p27 since cell cycle arrest induced by serum starvation did not significantly affect ER-mediated transcription. The effect of p27 on transcription was appeared to be ER-specific since overexpression of p27 did not significantly affect activities of other transcription reporters, TOPFLASH-luc, FHRE-Luc and NFκB-Luc. The inhibitiory effect of p27 on ER transcriptional activity was shown to be mediated by decreased nuclear localization of ER α by p27. Moreover, p27 could inhibit association of cyclin D1 with ER α which was previously shown to enhance ER α transcriptional activity by titrating cyclin D1 awawy from ER α.