Biological control of winter harmful algal blooms, Stephanodiscus hantzschii by using algicidal bacterium Pseudomonas fluorescens HYK0210-SK09

Abstract

호수 및 하천에서 식물플랑크톤은 봄철과 가을철에 높은 개체수를 보이고, 여름철과 겨울철에 낮은 계절적 차이를 보이고 있다. 특히 겨울철에 낮은 현존량은 저온, 저광량 및 짧은 광주기에 의해 영향을 받는다. 그러나, 전세계적으로 돌말 Stephanodiscus hantzschii는 겨울철 부영양화된 유수역 및 정수역에서 빈번한 대발생이 관찰되고 있다. 특히 우리나라의 한강 및 낙동강에서는 S. hantzschii가 겨울철 상시 대발생 되어 휴식 경관의 악화(이취미 발생 및 투명도 감소)와 식수공급을 위한 정수 처리 과정에 막대한 피해를 야기하고 있다. 이러한 사회보건상의 문제들에도 불구하고 아직까지 이 종의 대발생에 따른 피해를 줄이기 위한 연구들이 미비한 실정이다. 따라서, 본 연구는 S. hantzschii의 대발생을 효과적으로 제어하기 위한 종 특이적인 살조세균을 분리 및 살조 특성을 규명하였으며, 나아가 현장 적용이 가능한지를 파악하기 위하여 중형 폐쇄생태계 연구를 수행하였다. 또한 친 환경적인 살조능을 연구하기 위하여 분리된 살조세균을 담체화 시켜 현장 적용 실험을 수행하였다. S. hantzschii의 대발생을 제어하고자 살조세균 Pseudomonas fluorescens HYK0210-SK09를 팔당호에서 분리하여 SK09의 생리적 특성 및 세포내 살조물질을 규명하였으며, S. hantzschii를 제어하기 위한 살조밀도, S. hantzschii의 성장기별 살조범위 및 여러 조류들을 대상으로 살조능을 파악하였다. SK09를 총 5 x 106 cells ml-¹로 투입시, S. hantzschii는 5일내에 99% 이상의 높은 살조능을 보였다. 이렇게 높은 살조능을 나타낸 SK09는 S. hantzschii에 세포 표면에 부착하여 직접적으로 파괴하는 공격양상을 나타내었다. SK09내에서 살조물질은 주로 cytoplasm에 존재하고 있었다. 살조 범위 실험에서, SK09는 여름철 수화를 야기하는 남조 M. aeruginosa, A. cylindrica, 녹조 C. astroideum 및 S. hantzschii와 근연종인 돌말 C. meneghiniana에서 위 종들을 억제하지 못하여, 종 특이적 살조능이 보이고 있음을 알 수 있었다. 살조 특성이 규명된 SK09를 대상으로 S. hantzschii가 대발생된 현장에서 적용 가능성 여부를 파악하기 위하여 실내 및 현장에서 100 L 규모의 중형 폐쇄 생태계 실험을 수행하였다. 현장실험은 S. hantzschii가 10⁴ cells ml-¹이상의 대발생 될 때, 팔당호에서 수행하였으며, 실내 실험은 현장 실험과 동일 시기에 S. hantzschii가 대발생 된 현장수를 실내로 가져와 실험을 수행하였다. SK09를 5 x 106 cells ml-¹의 농도로 중형 폐쇄생태계에 투입시, 실내에서는 85%의 살조능을, 현장에서는 90%이상의 살조능을 보여 현장에서도 적용이 가능함을 시사하고 있었다. 그러나 본 연구에서 S. hantzschii의 세포 파괴에 따른 세포 내 용존 유기/무기 물질의 방출에 따라 영양염류의 빠른 증가를 보였다. 또한 식물플랑크톤 군집 변화에서, S. hantzschii의 감소는 영양염류의 증가와 더불어 Asterionella formosa, Aulacoseria granulata, Cryptomonas ovata와 Chlamydomonas sp.등의 상대적인 증가를 야기하였다. 중형폐쇄 생태계내의 미소생물들의 반응에서 SK09 접종 후에 30-50 μm의 섬모충의 증가를 보여, S. hantzschii 분해에 따라 증가된 박테리아를 포식하고 있음을 추정할 수 있었다. 이러한 100 L 규모의 중형폐쇄 생태계 연구는 현장에서 S. hantzschii 대발생의 제어가능성 여부의 판단이 중요 목적으로, 폐쇄 생태계 규모가 작고, 저질층이 포함되지 않아 자연생태계에서의 작용을 정확하게 설명하지 못한다는 단점을 가지고 있다. 따라서 기존의 중형폐쇄 생태계 연구의 문제점을 보완, 재현성 규명 및 나아가 심도 있는 생태계의 변화를 파악하고자 2 ton 규모의 중형 폐쇄 생태계 연구를 수행하였다. 2 ton 규모의 폐쇄생태계 연구는 낙동강에서 수행하였으며, 모래저질이 포함시켜, 저층으로부터 외부의 하천수가 원활히 교환될 수 있도록 구성하였다. SK09를 5 x 106 cells ml-¹로 투입시, 현장에서 대발생된 S. hantzschii는 8일에 85%의 높은 살조능을 보여, 선행된 100 L 폐쇄생태계 연구와 같이 현장에서 SK09가 S. hantzschii를 효과적으로 제어함을 알 수 있었다. 살조세균 처리에 따른 생태계의 변화를 보면, 선행된 100 L 폐쇄생태계와 같이 용존무기질소 및 규산염이 증가를 보였으나, 그 변화 폭은 상대적으로 낮았다. 특히 100 L 폐쇄생태계 실험에서 높은 인산염의 증가와 달리, 2 ton 중형폐쇄 생태계에서는 증가하지 않아, 저질 층으로의 흡수등에 따른 결과라 판단된다. 식물플랑크톤 변화를 보면, 돌말인 Navicula subminuscula 와 녹조인 Chlamydomonas sp.가 상대적으로 증가하였다. 이는 100 L 폐쇄생태계의 결과와 같이 S. hantzschii의 감소 및 영양염류 증가에 따른 반응이라 판단된다. 또한 섬모충 및 미소편모충은 투입된 SK09를 포함한 박테리아를 포식함을 알 수 있었다. 따라서 100 L와 2 ton 규모의 중형폐쇄 생태계 연구에서 직접적으로 투입한 SK09는 S. hantzschii대발생을 효과적으로 제어함을 알 수 있었다. 하지만 영양염류의 증가 및 식물플랑크톤의 천이 등의 생태계의 교란이 발생되고 있었다. 현장에서 직접적으로 SK09 투입에 따른 문제점을 보완하고자 SK09의 담체화시켜 현장에 적용 실험을 수행하였다. 먼저 효과적인 담체를 선정하기 위하여 APVAS 및 CS 담체를 사용하여 살조세균의 포집능 및 살조능을 파악하였다. SK09의 포집능 실험에서 APVAS 담체는 최대 1.61 ± 0.15 x 108 cells cm-³를, CS 담체는 최대 4.29 ± 0.67 x 107 cells cm-³를 보여 APVAS 담체가 높은 포집능을 나타내었다. 또한 S. hantzschii가 대발생된 5 L 현장수를 대상으로 살조능을 비교시, APVAS 담체는 최대 89.2%의 살조능을, CS 담체는 최대 73.2%의 살조능을 나타내어 포집능과 같이 APVAS 담체가 높은 살조능을 보였다. 특히 APVAS 담체를 넣은 실험구에서는 전기전도도가 CS 담체를 투입한 실험구보다 낮게 나타나 S. hantzschii 제어시 증가되는 이온들을 흡수하고 있음을 추정할 수 있었다. 이렇게 높은 활성을 보이는 APVAS 담체에 SK09를 포집 시켜 2 ton 규모의 현장 중형폐쇄 생태계에서 S. hantzschii 대발생 제어 실험을 수행하였다. 결과적으로 72.0%의 살조능을 보여 SK09의 직접 살포와 같이 높은 살조능으로 담체화로 현장 적용이 가능함을 시사하고 있었다. 특히 본 연구에서는 선행 연구와 달리 영양염류 제거 및 다른 식물플랑크톤의 천이양상을 감지하지 못하여 안정적으로 S. hantzschii의 대발생을 제어하고 있었다. 따라서 본 연구는 유해조류의 대발생을 제어할 수 있는 살조세균의 분리부터 현장 적용 및 응용 기술의 접목 등 향후 현장에서 유해조류의 대발생을 제어하였으며, 유해조류 제어 연구들의 나아가야 할 연구 방향 제시하였다고 판단된다.; An algicidal bacterium, Pseudomonas fluorescens HYK0210-SK09 (class Proteobacteria, gamma subdivision), was isolated from the Paldang reservoir of South Korea. SK09 was used to biological control of a small centric diatom, Stephanodiscus hantzschii, which annually harmful algal blooms during winter. The optimal inoculation density of SK09 was 5×106 cells ml-¹, which reduced S. hantzschii abundance by over 90% within 5 days. The algicidal mechanism of SK09 appeared to be a direct attack against the diatom, and algicidal compounds were mainly located in the cytoplasm. SK09 did not suppress Microcystis aeruginosa, Anabaena cylindrica in cyanophyceae, Coelastrum astroideum in chlorophyceae, or Cyclotella meneghiniana in bacillariophyceae; it appeared to attack S. hantzschii in a species-specific manner. To evaluate the ecological response of aquatic living organisms and the possibility of controlling natural S. hantzschii bloom, SK09 was applied to the natural bloom using indoor and outdoor 100 L small-scale mesocosms and a 2 ton large-scale mesocosm. When SK09 cells were inoculated at a final density of 5×106 cells ml-¹, S. hantzschii abundances were significantly decreased by maximums of 88% in ISM, 95% in OSM and 85% in LM. The microcosm in a laboratory revealed that the abundance of Pseudomonas increased rapidly after the inoculation with decrease of the diatom population. Inorganic nutrient concentrations increased after the destruction of the diatom cells. Abundances of phytoplankton species such as Chlamydomonas, Cryptomonas and Navicula species increased slightly with increased nutrient concentrations. Heterotrophic protists also increased significantly due to utilization of SK09 as foods. The present study demonstrated that the grazing pressure plays a crucial role for the success of the application of algicidal bacteria to natural environments. Since SK09 can grow its population by the algicidal activity and the threshold cell density is required to the algal cell lysis, spreading process of the algicidal bacteria after the inoculation in natural environments is important. Moreover, increase in nutrient concentration can cause other algal bloom. To determine an immobilizing efficiency of SK09, and an its algicidal activity against S. hantzschii, the algicidal bacteria were immobilized by activated carbon polyvinyl alcohol sponge and cellulose sponge carriers. As immobilization between two carriers, the APVAS carrier allowed for higher packing density of SK09 cells and higher algicidal activity against S. hantzschii compared to the CS carrier. Based on this result, the APVAS - immobilized SK09 cells were applied to control the S. hantzschii blooms in a field mesocosm. Immobilized SK09 cells exhibited a species-specific activity towards the diatom, showing an algicidal effect up to 72%. Moreover, dissolved inorganic nitrogen concentrations as inoculation of the carrier were effectively reduced at value from 1.42 mg l-¹ to 0.86 mg l-¹. Together, the study clearly demonstrates that APVAS - immobilized SK09 cells could control S. hantzschii blooms and improve the water quality in a mesocosm ecosystem. Therefore, SK09 may be an effective biological agent for controlling S. hantzschii blooms. Additionally, this immobilization strategy may be applied to a practical method for controlling the harmful algal blooms and improving water quality without ecological disturbances.