HER2에 의한 Cytokeratin19의 발현 유도와 세포내 이동 조절

Abstract

HER2를 과발현하는 MCF-7 HER2 세포주에서 특이하게 발현하는 cytokeratin19 (KRT19) 단백질을 단백질체학 방법으로 동정하였다. KRT19는 HER2/neu를 과발현하는 MMTV-neu 생쥐 유선과 자연적으로 HER2를 과발현하는 BT-474, SKBR-3 인간유방암세포주에서 mRNA와 단백질이 모두 과발현됨을 중합효소연쇄반응, 웨스턴블로팅, 면역세포화학법 그리고 면역조직화학법을 통해 확인하였다. 이 단백질이 HER2와 물리적으로 결합함을 상호면역침전법과 이중면역세포화학법으로 확인하였다. HER2 하위 신호전달 요소인 ERK의 활성에 의해 발현이 조절됨을 HER2 특이적 억제제인 ZD1839, ERK의 상위 요소인 MEK의 특이적 억제제인 U0126을 HER2 과발현 세포주에 일정시간, 일정농도로 처리한 후 웨스턴블로팅, 면역세포화학법으로 관찰하였다. KRT19 야생형 벡터의 인산화 부분을 point mutagenesis을 이용하여 KRT S10A, KRT S35A, KRT S10A S35A를 제작하였고 293T세포에 일시적 유전자도입 방법을 이용하여 웨스턴블로팅, 면역세포화학법을 통해 관찰한 결과 HER2 하위 신호전달 요소인 Akt에 의해 KRT19가 세포막으로 이동함을 확인할 수 있었다. 또한 HER2 과발현 세포를 세포표면 항원 염색법으로 염색한 후 세포분류기를 이용해 관찰한 결과 세포표면에도 존재하는 것을 확인함으로써 Akt가 KRT19의 세포 내 이동 조절을 유도 대한 검증을 할 수 있었다.; We utilized LC-MS/MS proteomics approach to identify proteins which are differentially expressed between human breast cancer MCF-7 VEC cells and MCF-7 HER2 cells engineered to overexpress oncogenic HER2. We found that several cytokeratins (KRTs) were significantly up-regulated in MCF-7 HER2 cells. Among them KRT19 was showed to be physically associated with HER2 and localized to membrane fraction upon HER2 overexpression. Studies with kinase inhibitors revealed that KRT19 expression was inhibited by treatment with HER2 receptor tyrosine kinase inhibitor (ZD1839) and MEK inhibitor (U0126) at both mRNA and protein level. Dual luciferase assays also indicated that transcriptional activity of KRT19 promoter was up-regulated in MCF-7 HER2 cells as compared to MCF-7 VEC cells. Experiments in 293T cells also revealed that co-transfection of HER2, MEK or ERK could increase transcriptional activity of KRT19 promoter reporter vector. Transient transfection studies using KRT19 expression plasmid in 293T cells indicated that co-transfection of HER2 or HER2-downstream kinase Akt, but not MEK/ERK, could induce KRT19 protein redistribution from cytoplasm to plasma membrane and its shape modification. When the putative Akt phosphorylation sites in KRT19 Ser10 and Ser35 had been mutated to alanine, the mutant KRT19 failed to exhibit membrane translocation and shape modification upon Akt co-expression, suggesting that HER2-downstream Akt-mediated phosphorylation on Ser10 and Ser35 residues are absolute and necessary requirement for KRT19 membrane translocation and shape modification. Taken together, the results suggest that HER2-downstream MEK/ERK signaling is responsible for KRT19 mRNA and protein up-regulation and another HER2-downstream Akt kinase activity is required for KRT19 trafficking and shape modification.