항체의 중쇄와 경쇄의 항원 인식능 비교 연구

Abstract

생쥐 하이브리도마에 의한 단일클론항체가 개발 된 이래 기초 연구뿐만 아니라 임상적인 응용에서도 치료 및 진단에 활용하기 위한 시도가 이루어 지고 있다. 하지만 생쥐의 단일클론 항체는 인체 내에서 면역반응을 유발시킨다는 근본적인 문제점을 가지고 있어서 임상적인 적용에 어려움이 있다. 이러한 문제점을 해결 하기 위하여 유전자 기술과 단백질공학적인 방법에 의하여 생쥐단일클론 항체를 인간화 시키거나 Fab 나 ScFv 같은 항체를 절편화 함으로서 임상적 부작용을 최소화 혹은 배제 시키려는 연구가 계속 되고 있다. 본 연구에서는 대장균 숙주를 이용하여 재조합 단백질로서 항체의 발현도를 높이기 위한 조건의 검토 및 이들 재조합 항체 혹은 그 절편 (light chain, Fd)의 친화도를 측정하여 항체의 항원 인식에 대한 각각의 기여도를 검토 함으로 단클론 항체의 항체 공학적 개발에 필요한 기초적 근거를 조사하였다. 먼저 생쥐 하이브리도마 세포 에서 AK3 와 친화도를 갖는 생쥐단일항체 SJ3B-36 의 total RNA를 추출하였다. 이 RNA 에서 cDNA를 합성한 후 light chain 과 Fd 를 증폭 시켜 E.coli vector로 cloning 하여 최종적으로 SJB3-36 의 light chain 과 Fd fragment 를 E.coli에서 발현시켰다. 이때 발현도 향상을 위해 항체절편 sequence를 E.coli vector에 삽입 시 형성 되는 mRNA의 2차 구조의 자유에너지를 예측하여 그 값이 낮은 vector를 최종적으로 사용하였다. 이렇게 발현 시킨 항체 절편들은 독자적으로 AK3에 특이적으로 결합 한다는 것을 western blot과 ELISA를 통해 확인 하였다. E.coli에서 발현된 항체 절편인 Light chain과 Fd fragment 의 각각의 AK3에 대한 친화도는 각각 SJ3B-36 항체와 competition ELISA 를 시행하여 측정하였으며, 그 결과 Light chain 은 full anti body 해리상수의 약 2,344 배인 5.86X10-6 M 의 해리 상수를, Fd 는 약 47.9 배인 1.975X10-7 M 의 해리 상수를 가진다. 이로써 SJB3-36 이 AK를 인식함에 있어 Heavy chain의 친화도 가 Light chain의 친화도 보다 약 49 배 정도 높다는 것을 확인 할 수 으며 이러한 친화도 차이는 heavy chain의 경우 light chain 보다 CDR의 amino acids 개수가 13개 많은 점이 였으며, 이와 같이 CDR region의 amino acids 개수와 친화도는 서로 비례 할 것으로 사료된다. 이러한 사실은 항체의 invitro affinity maturation을 수행 할 경우 light chain 의 mutation이 항원-항체 결합력 향상에 수월하게 적용 될 수 있을 것으로 판단된다.