토끼의 요추 디스크 손상 모델에서 인간 지방 유래줄기세포의 이식 효과에 대한 형태학적 연구

Abstract

퇴행성 디스크는 요통의 가장 흔한 원인으로 약 20% 정도를 유발하며 척추관 협착증, 수핵 탈출증 같은 질환과도 관련이 있다. 퇴행성 디스크 질환의 병인론과 치료를 위하여 많은 연구가 진행되고 있으나 아직 명확하게 밝혀지지는 않았으며 현재에도 퇴행성 변화의 속도를 늦추거나 되돌리기 위하여 많은 시도들이 되고 있다. 본 연구도 지방유래줄기세포(adipose-derived stem cell; ADSCs)을 디스크에 직접 주입하여 디스크 세포가 증식, 재생이 되는지 알아보고자 하였다. 무게가 2~2.5kg인 뉴질랜드 화이트종 토끼 20마리를 대상으로 먼저 퇴행성 디스크 토끼 모형을 만들었다. 부분 마취 후 경피적 방법으로 영상 유도 장치(C-arm)를 사용하여 요추 제2,3번간과 제 3,4번간과 제4,5번간 사이의 디스크 부위에 후측방 접근법으로 17게이지 척추 바늘을 사용하여 1회만 섬유륜에 구멍을 내고 수핵 중간 부위까지 바늘을 전진 시킨 후 제거했다. 외상 후 6주, 9주, 12주, 15주에 MRI로 퇴행성 변화를 확인 한 다음 19주째에 지방분화줄기세포 2⨯ 105cells in 100ul을 상기의 같은 경피적 방법으로 요추 제4,5번간 디스크 공간에 주입하였다. 요추 제 2,3번간은 외상만 준 대조군으로 사용되었고 총 20마리 중 10마리는 요추 제 3, 4번간에 식염수를 주입했고 나머지 10마리는 hyaline acid를 주입했다. 지방유래줄기세포는 지방 흡입술을 받는 환자에게 동의서를 받고 얻은 지방 조직을 collagenase 처리 한 후 원심분리기로 돌린 후 배양하여 준비했다. 재생이 되는지 확인하기 위해` 지방 분화 줄기 세포를 주입 후 4, 10, 18주째에 MRI를 시행했다. 또 세포 주입 후 10, 18주째에 각각 10마리씩의 토끼를 희생시킨 후 디스크 높이를 측정하고 염색하여 조직학적 소견을 관찰했다. 척추 바늘로 3부위의 디스크 공간에 외상을 준 후 정상 디스크와 비교할 때 모든 부위에서 퇴행성 변화가 시작되었으며 9주째에 MRI상에서 퇴행성 변화가 보이기 시작하고 15주째는 완전한 퇴행성 변화를 보였다. 위와 같은 경피적 방법으로 퇴행성 디스크 토끼 모형을 성공적으로 만들 수 있었다. 같은 방법으로 지방유래줄기세포 주입 후 4, 10, 18주에 MRI 촬영을 했으나 디스크의 재생은 확인 되지 않았다. 세포 주입 후 10, 18주째에 각각 10마리씩의 토끼를 희생시킨 후 측정한 디스크 높이에서 외상을 가하지 않은 정상 디스크도 높이 감소가 있었고 외상이 가해진 디스크는 더 가파른 감소를 보였다. 하지만 지방유래줄기세포를 주입 한 부위에서는 디스크 높이가 오히려 증가하는 모습을 보여 디스크 재생을 간접적으로 확인 할 수 있었다. 조직학적 소견에서도 지방유래줄기세포 주입 후 10주째에서 세포의 재생과 증식이 일어남 을 확인 할 수 있었다. 18주째에는 10주째와 비교하여 연골세포로의 재생과 증식이 더 많이 일어난 것 을 확인할 수 있었다. 하지만 수핵세포로의 분화는 확인할 수는 없었다. 수핵세포로의 분화가 진행되는지를 알아보기 위해서 더 장기간의 연구가 필요할 것이다.; Degenerative disc disease(DDD) is the most common cause of lower back pain(LBP). DDD comprises about 20% of LBP and is associated with other spine disease such as spinal stenosis, spondylolisthesis and herniated nucleus pulposus. There has been a lot of studies to identify the pathogenesis and treatments of DDD but to date, there is no established concepts regarding the pathogenesis and treatments of DDD. In addition, much has been attempted to decelerate DDD or reverse the course of degeneration. In this study, authors injected adipose-derived stem cells into the intervertebral disc space to verify the feasibilities of proliferation, regeneration of intervertebral disc cells. At first, degenerative disc rabbit models were made with white New Zealand rabbits weighing 2~2.5kg. Under local anesthesia with ketamine, 17 gauge spinal needle was inserted percutaneously to the intervertebral disc space of L2/L3, L3/L4, L4/L5 with posterolateral approach under the guidance of C-arm. The spinal needle made a puncture of the annulus fibrosus and was advanced to the middle portion of the nucleus pulposus and then removed. At 6, 9, 12, 15 weeks after traumatization, MR images were taken to find out degenerative changes. After confirming degenerative change on MRI, 2⨯ 105cells in 100ul of adipose-derived stem cells were injected to the L4/L5 intervertebral disc space percutaneously with 19 gauge spinal needle under the guidance of C-arm. The L2/L3 disc was used as a control group and L3/L4 disc space was injected with saline and hyaline acid in each 10 rabbits as a sham group, respectively. The ADSCs was obtained from patients who underwent liposuction surgery after an informed consent. Adipose tissue was processed with collagenase and centrifused and cultured to acquire the ADSCs. At 4, 10, 18 weeks after injection of the ADSCs, MRI was used to identify regeneration. At 10 and 18 weeks, each 10 rabbits were sacrificed to obtain histologic specimens. Disc height was measured and histologic findings were observed after staining. Three intervertebral disc spaces that were punctured showed degenerative changes compared to normal L1/L2 disc. Degenerative change was noted at 9 weeks after puncture and full degeneration was observed at 15 weeks by MRI findings. With this, authors concluded that degenerative disc rabbit models were successfully made with percutaneous technique. With same protocols, MRI were taken at 4, 10, 18 weeks after injection of the ADSCs to find out the process of regeneration in the intervertebral disc space of L4/L5. However, regenerative change was not identified. At 10, 18 weeks after injection of the ADSCs, 10 rabbits were sacrificed at each week for histology and measurement of disc height. Disc height was decreased even at normal disc level and punctured disc showed steeper decrement of disc height at 18 weeks compared to 10 weeks. However, the ADSCs-injected disc showed increased disc height at 18 weeks revealing regenerative change of the intervertebral disc. After staining, authors noticed that proliferation and regenerative change had occurred at 10 weeks. At 18 weeks, there was advanced proliferative and regenerative change to chondrocyte-like cells. However, there was no evidence of differentiation to the nucleus pulposus cells. More long-term study may promise a better result including identification of the nucleus pulposus cells.