핵자기공명법을 이용한 apolipoprotein B-100의 모조 항원 결정기 펩타이드 B4i 구조에 대한 연구

Abstract

Apolipoprotein B-100의 특이적 단클론 항체 B9의 항원 결정기가 인식하는 여러 가지 밝혀진 펩타이드에 대한 구조를 컴퓨터 시뮬레이션을 통한 분석으로 원래의 항원인 apo B-100과 아미노산 서열을 비교하여 일치하는 서열을 가진 펩타이드를 찾아내었다. 그 결과 apo B-100에 대한 단클론 항체가 인식하는 펩타이드는 MDRNVPPIFNDVYWIAF(pB1)으로 확인되었다. 이들 펩타이드의 아미노산 배열은 원래의 항원인 apo B-100에는 존재하지 않았으며, 아미노산 1차 배열만을 BLAST search로 비교하였을 때 pB1은 apo B-100과 40％의 상동성이 확인되었다. pB4i 인공 유전자 작성은 PCR 방법을 이용하여 증폭하였다. Host cell을 이용하여 재조합 peptide B4i를 발현시켰고, 발현된 peptide B4i를 정제하여 pB4i를 최종 합성하였다. 본 연구에서는 CD(Circular Dichroism) 분광 편광을 측정하여 pB4i의 전체적인 2차 구조를 알아보았다. CD를 통해 pB4i에 TFE 용매 존재하에 구조적으로 변화가 있는 것으로 나타나 pB4i와 20% TFE를 포함한 pB4i를 두가지 조건으로 NMR 실험을 실행하였다. 또한 1H-NMR, 2D NMR(COSY, TOCSY, NOESY) 실험을 통하여 mimotope 펩타이드 pB1 sequence가 4번 반복된 구조 (pB4i)의 신호를 지정하였고, NOESY 스펙트럼에서 얻은 NOE 신호를 바탕으로 수소들간의 거리 정보를 얻었다. 이를 바탕으로 distance geometry(DG)와 molecular dynamic(MD)을 수행하여 mimotope pB4i의 3차원 구조를 결정하였다. 이 mimotope 펩타이드 모두 DG 구조의 최종 penalty값은 pB4i와 20% TFE를 포함한 pB4i 각각 0.2Å2와 0.09Å2을가지며, 전체 DG 구조를 겹쳐 놓은 것의 RMSD값은 두 펩타이드 모두 0.6Å을 나타내었다. Mimotope pB4i은 2개의 Proline에 의한 folding과 β-turn 구조를 나타내고 있다. Ramachandran plot을 통해 두 펩타이드 모두 α-helix와 β-sheet, β-turn구조가 부분적으로 나타남을 볼 수 있었고, 20% TFE를 포함한 pB4i가 α-helix구조에 더 가깝게 나타났다.; Lipid metabolic diseases including atherosclerosis, heart attack, obesity, and hypercholesterolemia come from abnormal metabolism of LDL-cholesterol. The LDL with oxidized cholesterol, major cholesterol-carrying particle in plasma, is endocytosed via LDL receptors or phagocyted by scavenger macrophages, leading to the cholesterol transfer into HDL. The cholesterol in HDL is excreted through liver as a form of bile salt. Apolipoprotein B-100 (apo B-100), the major protein of LDL, is the true ligand for LDL receptor at liver or other specific tissue requiring cholesterol. It could therefore be hypothesized that the antibodies against apo B-100 mimetic peptide enhances the formation of immune complexes with LDL. Mimetic peptides for the antigenic determinant of apolipoprotein B-100, eliminated by scavenger macrophages, were chemically synthesized and used as antigens for the induction of humoral immune responses to LDL. The resulting antisera against the mimetic peptide (PB1) recognized the PB1 peptide, apo B-100 and LDL. pB4i, four folds of pB1, were prepared for therapeutic vaccine for the lipoprotein metabolic disorder related diseases such as obesity and arteriosclerosis. Conformational change of pB4i was monitored by circular dichroism (CD) spectroscopy. The CD spectra of the mimotope pB4i in TFE solvent showed a wide negative through between 210 and 230 nm indicating helical form of peptide. 1H-NMR and 2DNMR (COSY, TOCSY, NOESY) experiments were accomplished to make complete NMR signal assignments of mimotope peptides. Distances of proton pairs were obtained based on the NOE cross peak intensities. Distance geometry(DG) and molecular dynamic(MD) were carried out to determine the tertiary structure of mimotope pB4i. DG structures of mimotope pB4i have the penalty value 0.2Å2, and total RMSD 0.6Å in superposition of all atoms. Whereas, pB4i under TFE solvent has a penalty value 0.09Å2, and a total RMSD value 0.6Å. Comparison of the average secondary structure between pB4i and pB4i in TFE solvent by using Ramachandran plot shows that two different peptides exhibit an unique conformation with combination of α-helix, β-sheet and β-turn. pB4i exhibits a folding turn two proline and shows similar β-turn structure in the entire peptide structure. Structural analyses show that pB4i in 20% TFE solvent result in more α-helical form in the entire peptide skeleton.