지방세포에서 비중을 이용한 지방유래줄기세포 분획의 분리방법 규명

Abstract

Ⅰ. Stromal Vascular Fraction의 비중에 따른 분획별 지방세포 분화도 연구배경: 지방조직은 골수 유래의 중간엽 줄기세포와 같은 다분화 능력을 가진 성체줄기세포를 포함한다. 지방조직으로부터 추출한 지방유래 줄기세포가 다양한 분화 유도를 통해 지방세포, 골세포, 근육세포로 분화할 수 있음이 밝혀졌다. 본 연구에서는 지방조직으로부터 얻은 기질세포에서 지방세포로의 탁월한 분화능력을 가지고 있는 순수한 지방유래 줄기세포를 추출해 낼 수 있는 지 알아보았다. 방 법: 수컷 Sprague-Dawley rat(n=15)의 4부위 지방조직(Subcutaneous adipose tissue, epididymal adipose tissue, mesenteric adipose tissue, retroperitoneal adipose tissue)에서 불필요한 조직을 제거한 나머지 기질세포만을 얻는다. Nycodenz를 이용하여 기질세포를 밀도차등 원심분리하여 4개의 분획을 얻어 각각을 배양시킨다. 포화 상태에 이른 지방줄기세포를 지방세포로 분화를 유도하여 세포 내 지방 축적 여부를 염색을 통해 확인한다. 결 과: 밀도차등 원심분리로 지방조직 기질세포는 4개의 분획(Fx-1, Fx-2, Fx-3, Fx-4)으로 나뉘었으며, 4부위 지방조직 모두 세 번째 분획(Fx-3)의 세포 수가 가장 많았다. 그러나 지방세포로의 분화는 4부위 지방조직 모두 두 번째 분획(Fx-2)에서 탁월했으며 분획을 나누지 않은 것(Control)과 비교했을 때 더 나은 분화 능력을 보였다. 지방으로 분화가 가장 잘 되는 지방 조직은 Retroperitoneal adipose tissue였으며 그 다음이 Subcutaneous adipose tissue였고, Epididymal adipose tissue는 상대적으로 분화율이 떨어지는 것을 관찰하였다. Mesenteric adipose tissue는 분화가 거의 되지 않았다. 결 론: 지방조직별, 밀도별로 지방조직 기질세포를 나누어 분리함으로써 지방조직으로의 분화 능력이 우수한 지방줄기세포를 찾을 수 있었다. 향후 기질세포를 이용한 연구 및 활용에 있어서 지방조직별, 분획별 기질세포의 이용으로 일관된 결과를 얻는 데 도움이 될 것이다.

Ⅱ. Stromal Vascular Fraction의 분화방법에 따른 분화율의 차이 연구배경: 지방세포의 분화를 유도하는 가장 일반적인 방법은 insulin, IBMX, glucocorticoid 및 indomethacin이다. 본 연구에서는 지방조직으로부터 추출한 SVF를 분화에 영향을 미치는 약물의 투여 방법을 다르게 하여 분화율의 차이를 살펴보았다. 또한 계대배양에 따라 각 지방조직의 기질세포 내 세포 조성에서 ASCs의 특성에 차이를 나타내는 지 알아보았다. 방 법: Long-Evans Tokushima Otsuka (LETO) rat으로부터 수집한 SAT의 SVF는 MDII medium (MDI medium, 200μM indomethacin)를 처리한 다음 1일은 insulin medium을 처리하는 방법을 3회 반복하였다. RAT의 SVF는 MDI medium (520μM 3-isobutyl-methylxanthine (IBMX), 1μM dexamethasone, 1㎍/㎖ insulin)과 Insulin medium (1㎍/㎖ insulin)을 각각 2일씩 3회 반복 처리하여 분화를 유도하였다. Sprague-Dawley (SD) rat은 SAT와 RAT를 채취하여 MDIT medium (MDI medium, 20㎍/㎖troglitazone) 2일, insulin medium 2일을 처리하여 분화를 유도하였다. 결 과: MDI medium의 반복처리는 LETO rat의 R-SVF의 지방세포로의 분화율을 향상시켰으며, indomethacin의 첨가 역시 S-SVF의 분화율을 증가시켰다. 또한 troglitazone은 SD rat에서 S-SVF와 R-SVF의 분화율을 증가시켰다. SVF를 계대배양한 경우 0passage에 비해 지방세포로의 분화율이 2배 이하로 반감되었다. 결 론: Adipogenic medium의 반복처리 또는 PPARγ ligand의 첨가는 지방세포로의 분화를 향상시키며 계대배양은 기질세포 내 지방유래줄기세포의 특성을 감소시켰다.

Ⅲ. Rat의 주령 및 종류에 따른 Stromal Vascular Fraction의 분화도 연구배경: 본 연구는 주령별 rat의 지방조직의 SVF를 밀도차등원심분리를하여 보다 순도가 높은 분획을 찾는 동시에 지방세포로의 분화시 주령별 차이를 알아보고자 하였다. 또한 당뇨병 모델 rat을 이용하여 질병 유무에 따른 기질세포의 지방세포로의 분화능의 차이를 알아보고자 하였다. 방 법: Sprague-Dawley (SD)rat 8, 15, 23주령 및 15, 31주령의 당뇨병 모델인 Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty (OLETF) rat과 대조군 모델인 Long-Evans Tokushima Otsuka (LETO) rat의 Subcutaneous adipose tissue로부터 기질세포를 비중에 따라 분획을 나누었다. 포화 상태에 이른 지방줄기세포를 지방세포로 분화를 유도하여 세포 내 지방 축적 여부를 염색을 통해 확인한다. 결 과: 주령이 증가됨에 따라 SAT의 양은 증가하였고 기질세포의 양은 쥐의 종류에 따라 약간의 차이가 있어 Fx-3 또는 Fx-4가 많았다. 분획을 나눈 것이 분획을 나누지 않은 것과 비교해서 분화율이 더 좋았으며 주령에 따라 차이가 있었다. 분획별로는 주령별, 쥐의 종류에 따라 차이는 있었지만 Fx-1, Fx-2의 분화율이 높았다. 결 론: 본 연구는 주령에 따라 SVF의 지방줄기세포로서의 특성에 차이가 있으며, 이를 지방세포로의 분화를 통해 확인하였고, 질병 유무에 따른 차이 또한 확인할 수 있었다.