전기화학 방식의 Neisseria gonorrhoeae (임질균) 진단 바이오칩 개발

Abstract

최근에 생명과학 및 유전 공학의 이론 및 기술의 급격한 발달은 사람들의 건강에 대한 관심도를 증가시켰다. 최근에는 조기 진단의 중요성이 부각되고 있으며, 굳이 병원이 아니더라도 생활하는 범위 안에서 직접 질병을 검출할 수 있는 시스템 (POCT; Point of care testing) 개발의 필요성 또한 중요시 되고 있다. 성병(Sexually Transmitted Disease, STD)이란 일차적으로 사람과 사람 사이에서 성적인 접촉을 통해 전염되는 질환을 말한다. 흔한 성병으로는 임질, 매독, 성기 클라미디아 감염증, 트리코모나스증, 후천성 면역결핍증 등이 있다. 그 중 가장 대표적인 성병인 임질은 성관계를 통해 임균에 감염되어 발생하는 남성 및 여성 생식기의 감염증으로 행위를 통해 감염된 임균은 남성과 여성 비뇨생식기에 염증을 일으킨다. 하지만 기존의 성병 진단 방법으로는 검출 시간이 오래 소요되고 시약과 샘플의 비용이 많이 들며, 비교적 부피가 큰 검출장비가 필요하다는 단점이 있기 때문에 현장 검출 시스템에 적용하기에는 어려운 상황이다. 따라서 이러한 단점들을 극복하기 위해 최근에 반도체 기술이 접목된 Bio-MEMS (micro electro mechanical system)와 생명과학 분야가 융합된 바이오칩 (biochip)의 연구가 전세계적으로 활발히 진행되고 있다. 바이오칩 (biochip)은 DNA, RNA, 단백질, 항체 또는 세포 등 기존의 어떠한 반응을 갖는 생체물질들을 수 mm 크기의 유리, 실리콘, 고분자 등의 고체기질 위에 고밀도로 집적화한 생체정보 감지소자를 말한다. 본 연구는 성병의 한 종류인 임질균에 대한 바이오칩 개발에 있어 생화학적 실험조건의 최적화와 LOC (Lab-on-a-chip) 형식의 바이오칩 개발 및 적용에 대해 크게 두 가지 부분으로 나뉘어 연구가 진행되었다. 먼저 생화학적 실험 조건의 최적화에 있어서는 여러 가지 활성 조건 (반응시간, 농도)을 최적화 하였다. 그리고 제작된 칩에서의 적용성 여부를 테스트 하였다. 그리고 최적화된 조건하에서 임질균이 농도 별로 검출이 되었으며 반복실험을 통해 통계적으로 검출 유효성을 검증하였다. 본 연구는 바이오칩 기술을 이용하여 임질균을 전기화학적 신호를 통해 정량적으로 검출하는 것을 목표로 한다. 본 실험에서는 먼저 DNA probe의 농도를 변화시켜가면서 반응성을 CLSM (Confocal laser scanning microscope)을 통해 관찰하여 DNA probe와 작업전극 (WE, working electrode) 인 Au, 그리고 참조전극 (CE, counter electrode)과 기준전극 (RE, Reference electrode)인 Pt 사이의 반응성을 확인하여 최적화된 반응 조건을 찾았다. 그 결과 DNA probe가 Au 전극과 특이적으로 반응하여 고정화 되는 조건을 확인 하였다. 임질균 시료는 genomic DNA를 사용하였고 칩은 유리기판과 PDMS (polydimethylsioxane)로 구성되어 있으며 PDMS에 의해 마이크로 (micro) 크기의 유로 (channel)가 형성되어 있다. 또한 전극 (electrode)은 두 개로 구성되어 하나는 실제적으로 전기화학적 신호가 검출 되는 전극을 금 (Au)으로 만들고 하나는 그 반응에 대한 참조하는 전극과 기준이 되는 전극을 하나로 통합하여 그 전극은 백금 (Pt)으로 전극이 형성하여 전기화학적 신호를 측정할 수 있게 하였다. 전기 화학적 검출 방법은 Cyclic voltammetry (CV)와 Chronoamperometry (CA) 검출 방법을 사용하였다. 임질균 검출용 DNA probe를 gold sulfur interaction에 의하여 gold 작업 전극 부분에 고정시키는 조건은 선행실험을 통하여 확인한 방법으로 수행하였고 여기에 PBS buffer와 D.I water를 이용하여 비특이적 결합을 제거한다. 여기에 소량의 임질균 genomic DNA 샘플을 주입하여 1시간 동안 반응 시켜 DNA probe와 임질균의 genomic DNA가 충분히 반응할 수 있게끔 유도한다. 검출방법으로 DNA probe와 임질균의 결합 시에 나오는 이온간의 이동을 산화• 환원 반응을 이용하여 반응의 세기를 통한 상대적인 값을 비교함으로써 정량적으로 측정하였다. 여기서 사용되는 CV는 삼각파 형태의 전압이 가해질 때 전압과 전류 사이의 관계를 측정할 수 있는 검출방법이고, CA는 일정한 전압을 걸어 준 후 시간에 따른 전류의 변화를 측정하는 검출 방법으로써 이를 통해 정량화 하는 것을 목표로 하였다. 이때의 전기화학적 신호 변화는 외부 검출 장비를 통해 정량적으로 검출되었다. 결과적으로, Bio-MEMS 기반의 바이오칩이 성공적으로 제작되었으며 칩 상에 구성되어 있는 전극 시스템에 우리가 원하는 샘플을 검출 할 수 있는 DNA probe를 쉽게 고정화 시킬 수 있었다. 또한 매우 단순한 구조이기 때문에 제작이 쉽고 대량제작 또한 가능하다는 이점이 있다. 본 연구에 쓰인 전기적화학적 검출 시스템은 기존 검출 보다 검출장비의 부피를 축소시킬 수 있으며 시료 주입과 이동 그리고 반응을 위한 펌프 (pump), 반응용 챔버 (reaction chamber) 등이 집적화되면 POCT를 위한 휴대용 검출 기기의 연구개발에 효율적으로 쓰일 수 있는 기초 기술 개발이 될 수 있을 것으로 생각된다.