단백질의 리포좀 봉입 공정 특성

Abstract

친수성 내부 공간을 가지는 구형 리포좀에 단백질을 봉입시키는 기술은 단백질 약물을 이용한 표적전달, 효소의 고정화 반응, 바이오나노 센싱 등 다양한 분야의 적용으로 주목받고 있다. 리포좀의 단백질 봉입수율은 일반적으로 극히 낮으므로, 산업적인 용도로 사용하기 위해 이를 상승시키는 기술이 요구되는 반면에 단백질을 봉입한 고수율의 리포좀 제조 방법에 관한 문헌은 많지 않으며, 기초적인 특성 분석도 완전히 설명되지 않았다. 이 실험에서 봉입체로 사용된 효소는 물리적, 화학적 특성이 단백질 의약과 유사하며 생물학적 활성을 측정하기 용이하기 때문에 단백질을 대체하여 사용되었다. 본 연구에서는 DPPC (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)로 리포좀의 인지질 성분을 고정시켜 놓고 100, 200, 400 nm 직경의 리포좀을 대상으로, 지질의 농도와 봉입수율에 미치는 영향을 조사하였다. 버퍼 pH와 이온강도가 봉입 수율에 미치는 영향을 조사하기 위해 봉입체를 trypsin으로 고정한 후 DCP (dicetyl phosphate)를 첨가하여 음전하를 나타내는 리포좀을 제조하였다. 또한, 단백질의 전하를 조절하여 봉입수율을 향상시키기 위해 양전하를 나타내는 인지질인 DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimethyl-ammoniumpropane)과 음전하를 나타내는 인지질인 DCP를 첨가하였다. 제조된 리포좀은 크기배제 크로마토그래피 (SEC)에 주입되어 리포좀과 봉입되지 않은 단백질로 분리되었고, 피크면적을 통해 봉입수율이 결정되었다. 봉입수율은 다시 SE (encapsulation weight per liposome)와 SN (number of enzymes per liposome)의 단위로 변환하여 하나의 리포좀 분자 당 봉입 수율을 설명하였다. 연구결과 봉입 수율은 단백질과 인지질 사이의 정전기적 인력에 의해 결정되며, 버퍼 pH와 이온 강도, 전하를 나타내는 지질 첨가를 통해 봉입 수율과 단백질 활성을 향상시킬 수 있음을 확인하였다. 이와 같은 접근은 높은 봉입 수율과 단백질 활성을 갖는 최적의 봉입 조건을 결정하여 단백질의 리포좀 봉입을 통한 약물 표적전달 등에 사용될 수 있을 것으로 기대된다.; Encapsulation of proteins inside the hydrophilic core space of liposomal vesicle is an important issue in such applications of targeted delivery of therapeutic proteins and immobilized reactions of industrial enzymes, and bionano sensing of diagnostic proteins . The encapsulation yield is generally quite low and needs to be improved for industrially viable applications. While a few literatures reported the methods of liposomal encapsulation of proteins for high yield, fundamental characteristics of protein encapsulation inside a liposome was not fully elucidated. In this study, by fixing the phospholipid as DPPC (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), we evaluated the effects of such operational parameters as protein size (i.e., trypsin, 15 kDa; horseradish peroxidase, 44 kDa; hyaluronidase, 80 kDa; enterokinase, 250 kDa), liposome size (nominal 100, 200, 400 nm in diameter), phospholipid concentration, buffer pH, and salt concentration on protein encapsulation yield. A size exclusion chromatography technique was applied to separate liposomes and free (unencapsulated) proteins. The encapsulation yields ranged between 10 to 35 %, depending on protein. We found that the encapsulation yield was mainly driven by electrostatic interactions between phospholipid and protein, and the bioactivity of the encapsulated protein was significantly affected by buffer pH and salt concentration. Addition of a charged phospholipid was found to enhance the encapsulation yield by increasing the electrostatic affinity between a protein and phopholipid. This approach can be used to scout the optimal encapsulation condition for high yield and bioactivity.