무혈청 배지에서 칼슘 조절에 따른 재조합 CHO-DG44 세포별 현탁 배양 특성 비교

Abstract

본 연구에서는 강화 DMEM/F12 배지를 이용하여 Chinese hamster ovary DG44 (CHO-DG44) host 세포와, 동일한 host 세포를 유래로 같은 transfection 과정을 거쳤으나 selection이 다른 세 종의 recombinant CHO-DG44 (rCHO-DG44) 세포를 이용하여 칼슘 농도에 따른 세포 성장과 응집을 관찰하였다. 모든 세포는 저농도의 칼슘 환경에서 가장 좋은 성장을 보였으며, 칼슘의 농도가 올라갈수록 세포의 응집이 커지고 세포 농도가 감소하는 결과를 보였다. 그러나 selection이 다른 세 종의 rCHO-DG44 세포는 칼슘 농도에 따라 각각 다른 성장과 응집 발생을 보였으며, 이러한 결과를 통해 세포의 성장과 응집 문제를 해결해 주기 위해서는 저농도의 칼슘 이온으로 세포를 배양해 주는 것 외에도 세포 응집이 적게 발생하는 세포를 select하는 것이 중요함을 알 수 있었다. 본 연구실에서는 Fe2+가 포함된 상용 iron supplement를 첨가하여 실험 진행 시 칼슘 이온 농도에 따른 세포 성장과 응집이 다르게 변하는 것을 확인하였다. 상용 iron supplement 성분 중 chelate agent로 주로 사용되는 ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)와 aurintricarboxylic acid (ATA)를 첨가하여 세포 성장 실험을 진행한 결과 EDTA를 첨가한 모든 실험군은 세포 성장이 저해됐으며, 높은 EDTA 농도에서는 세포가 성장하지 못하였으나 다소 높은 칼슘 농도에서의 EDTA 첨가 실험군에서는 세포 성장이 가능했다. 반면 ATA를 첨가한 경우 고농도의 칼슘 이온이 첨가된 배지에서는 세포의 성장을 돕는 것을 확인했다. 이를 통해 배지 내 EDTA는 첨가량 증가 시 응집 방지에는 큰 효과가 없으며, 고농도 칼슘 이온이 첨가된 배지를 사용 시 ATA가 세포 응집을 방지하여 성장을 돕는 역할을 할 수 있음을 확인했다.; Calcium is a critical parameter required for influencing the interaction of both the cell-cell and the cell-matrix. In this study, we observed how the phenomenon of different aggregation characteristics by calcium levels with CHO-DG44 host cell line and various rCHO-DG44 cell lines recombination by same host cell line and expressing identical proteins but selected differently. And we induced cell growth using aurintricarboxylic acid (ATA) and ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA), that repress cell aggregation and making culture possible in high calcium concentration medium. As a result, in a modified DMEM/F12 with calcium ions controled, all of CHO-DG44 cell lines were aggregated in culture with high calcium concentration. And when the medium supplied with CaCl2․ 2H2O 5mg/L and 10mg/L, cell growth measured the highest score among others and also keeps low mean diameter. However, various of rCHO-DG44 cell lines have different growth in each calcium concentrations. For example, rCHO-DG44 cell line (A) has more aggregation and low viable cell density in CaCl2․ 2H2O 30mg/L than rCHO-DG44 (B), (C) cell lines. Furthermore, the more differential of mean diameter and viable cell density each cell lines when the CaCl2․ 2H2O 50mg/L and 100mg/L. And we observed the EDTA is decreasing of cell density in suspension culture and non effects of cell-cell aggregation. But ATA is effective of reducing cell-cell aggregation and it also keeps single cell when high calcium ion concentrations in serum-free medium. In conclusion, low calcium concentration advantage to the cell growth. cell selection is the most appropriate method for favorable cell growth and low cell aggregation.