심근경색증진단의 신규 마커로서의 Adenylate kinase의 특성과 임상적 활용

Abstract

Adenylate kinase(AK)는 생물계에서 약 40여 종의 다양한 subtype이 보고되고 있으며, 사람을 포함한 척추동물의 세포에는 AK1, AK2, AK3, AK4, AK5, AK6 그리고 AK7 등7종류의 isozyme이 존재하고 있다. 본 효소는 가역적 인산기 전이반응을 촉매하므로 세포내 ATP, ADP 및 AMP의 신속한 동적 평형을 유지시키는 역할을 담당하여 생체 에너지대사에 있어서 매우 중요한 효소이다. 최근 AK는 세포 신호 전달과 관련된 인산화 반응으로 apoptosis, tumorigenesis 등에도 관여하고 있음이 밝혀져 생리학적 의의가 새롭게 연구되기 시작하였다. 선행연구에서 hAK1 및 human mitochondrial AK isozyme인 AK2와 AK3의 대량 발현계를 확립하였고, AK의 생리 화학적 특성을 규명하였다. 본 연구에서는 저산소증에 의해 심근이 파괴되었을 때 나타나는 질병인 급성 심근경색증을 진단하는데 있어서 조직 특이적으로 발현되는 AK의 특성을 이용하여 기존에 진단에 사용되는 myoglobin, troponin T (TnT), troponin I (TnI), creatine kinase-MB isozyme (CK-MB)등의 진단 지표를 대체 할 수 있는 AK3의 활용가능성 및 임상적 활용가능성을 제시하고자 하였다. AK3를 검출하는 최적의 조건을 연구하기 위해서 AK3에 대한 단클론 항체를 제작 및 선별하였다. 선별된 항체들은 면역한 항원의 isozyme에 대한 교차반응 인식능을 AK isozymes 각각에대하여 ELISA를 이용 비교하여 AK3에만 특이적인 항체를 확인 후 선별하였으며, 추가적으로 혈청단백과의 비특이적인 교차반응성역시 배제되어진 항체들을 선별하기 위하여 혈청과 항체를 우선 결합시킨 시료와 혈청만을 결합시킨 시료를 이용하여 ELISA를 수행하였다. 이후 형청만을 처리한것과 혈청과 항체를 미리반응시킨 시료의 수치값의 차이가 일정수치이상 높거나 낮아지는 항체는 혈청반백과의 교차반응이나 간섭이 발생하는 것이므로 선별과정에서 제거되어졌자. 이렇게 선별되어 정제되어진 항체는 IgG1및 IgG2b isotype이었으며 모두 κ의 light chain을 가졌음을 확인하였다. 이렇듯 선별되어진 항체들은 혈청 내 존재하는 AK3의 농도를 알아내기 위한 Sandwich ELISA에 capture detector로서 사용이 되어졌으며, 또한 이를 이용하여 POCT kit를 제작하여 임상적 활용여부를 test 하였다. 혈청을 이용한 ELISA의 가장 큰 문제는 혈청단백과의 비특이적인 교차반응성의 배제인데, 비특이적 false signal을 주는 요인에는 pH, 이온 강도, detergent, plasma proteinase와 human anti-animal antibodies들로 밝혀졌으므로 assay buffer에 BSA, bovine IgG, triton X-100을 첨가하고, pH를 7.4로 맞춰줌으로써 혈청단백에 의한 false signal을 최소화 할 수 있는 최적의 assay buffer 조건을 확립하였다.이 buffer를 혈청과 사용시 희석비율은 혈청 75ul에 assay buffer 25ul로 하는 것이 가장좋은 결과를 나타냈다. 최적의 조건으로 ELISA를 수행한 결과 AK3는 0.2 ng/㎖ (TMB 사용시) 이상의 농도 범위에서 혈청 내 AK3를 검출 할 수 있었으며, 이 결과는 동일실험을 최소4회이상 반복하여 실험의 정확도를 나타내는 CV%가 10%미만으로 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 하지만, 동일 Lot.으로 준비한 시료를 동일한 날에 사용하면 CV%의 정확도는 매우높으나, 다른 Lot.으로 준비한 시료를 사용시 CV%는 15%까지 차이가 나는 것을 확인 할 수 있었다. 이는 매우 소량의 AK3를 사용하는 실험에서 미세한 실험적 조작의 차에에서 기인하는 것으로 보인다. 이러한 결과에 기인하여 제작되어진 POCT kit test는 혈청이나 플라즈마의 사용시 그 검출 한계가 0.5 ng/㎖이었으며, 이 진단 kit를 사용하여 임상시료를 test한 결과는 기존 급성심근경색 마커에 양성이며 AMI확진을 받은 환자 41case를 test 한 결과 35case에서 양성반응 나타나 임상분석 민감도는 85%에 이르렀으며, 기타 일반혈청 및 비순환기성 질병환자혈청을 대상으로 한 test 에서는 모두 음성의 결과를 얻었다. 이러한 결과는 troponin이 95%의 정확성을 나타내는 것보다는 떨어지는 수치이나, 초기진단 마커로 사용중인 myoglobin의 정확도가 30% 이내이고, 기존 마커의 하나인 CK-MB 가 70%의 정확성을 나타내는것과, troponin이 심근경색의 발병 후반에 검출되는 것을 감안하면 조기진단의 관점에서 보면 가장 우수한 정확도를 갖는 진단지표라 할 수 있다. 따라서 AK3는 myoglobin 및 CK-MB와 비교하여 조기진단 및 정확성 측면에서 매우 뛰어나다고 말 할 수 있다. 이에 AK3는 조기진단 생화학적 마커로서 새로운 심근경색증을 포함하는 순환계 심근상해의 조기 진단지표로의 활용가능성 충분함을 확인 할 수 있었으며, 심장질환의 예후 판단에 널리 사용되어질 것으로 기대되어진다.. 본 연구에서 제작되어진 hybridoma 세포주는 AK3에 대한 항원-항체의 다양한 특성 연구, 생체 조직 및 시료들에 있어 AK3의 면역 화학적인 추적이 가능한 기반을 마련하였을 뿐 아니라, 이후의 연구에서는 AMI의 경시효과에 따른 AK3혈중 유출량 및 진단의 감도를 더욱 높일 수 있는 실험법에 대하여 향후 더욱 면밀히 검토하여야 할 것이다.