Study of early GABAergic differentiation in the mouse embryonic carcinoma stem cells

Abstract

가바성 신경세포는 중추신경계에서 억제 역할을 하는 주요 세포로써 gamma amino butyric acid (GABA) 를 신경전달물질로 사용한다. 최근 여러 연구를 통하여 배아줄기세포로부터 가바성 신경세포로의 분화를 유도 하기 위하여 여러 노력들이 시도되어 왔다. 그 예로, stromal 세포위에서 신경세포로의 분화를 유도하거나, 배아줄기세포에서 신경으로의 분화가 시작된 neurosphere 상태에서 retinoic acid (RA) 와 brain derived neurotrophic factor (BDNF) 같은 물질을 처리하므로써 신경세포로의 분화를 관찰한 바가 있었다. 또한 신경전구체세포 (neuronal precursor cells, NPC)에서 protein kinase B (Akt)의 활성화로 인하여 mash1 유전자가 활성화 되어 가바성 신경세포로의 분화를 유도 시키는 것이 관찰 되었다. 본 연구에서는, 세포이식에 보다 적합한 환경의 분화된 가바성 신경세포를 얻을 수 있는 유도조건을 찾기 위하여, stromal 세포가 없는 상황에서 배아 암종줄기세포로부터 가바성 신경세포로의 분화를 유도 시킬 수 있는 조건을 알아보고자 하였다. 먼저, 배아암종줄기세포에서 가바성 신경세포로의 분화가 기존 조건에서 진행될 수 있는지 알아보기 위하여 stromal 세포가 함께 배양되는 조건에서 가바성 신경세포로 분화를 유도시킨 결과, 가바성 신경세포의 표지 물질인GAD 65/67 단백질의 발현이 증가된 것을 western blot, immunocytochemistry 분석방법을 통하여 관찰 할 수 있었다. 이어서 stromal 세포가 없는 환경에서 가바성 신경세포로 분화를 유도하기 위하여, RA와 BDNF를 이용한 6 일간의 분화 프로토콜을 진행시킨 결과, 가바성 신경세포로의 분화를 western blot과 RT-PCR을 이용하여 가바성 표지물질인 GAD 65/67, GABA B R1 단백질의 발현이 증가하는 것으로 확인 할 수 있었다. 또한 초기 가바성 신경세포로의 분화에 Akt 신호전달이 미치는 영향을 알아보기 위해, Akt 신호전달 억제제와 활성제를 분화시작 5일 뒤에 24시간 동안 처리한 결과, Akt 신호전달의 변형은 가바성 단백질 표지물질의 발현은 증가시킨다는 것을 western blot을 통하여 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과는 stromal 세포가 없는 환경에서 유도시키고자 시도한 초기 가바성 신경세포 분화 프로토콜이 치료를 목적으로 한 미래의 세포이식연구에 이용될 수 있음을 시사한다.; GABAergic neuron is the major inhibitory neuron in the central nervous system (CNS). Previous studies have suggested that embryonic stem cells can be differentiated into GABAergic neuron on the stromal cells and GABAergic differentiation from neurosphere derived cells can be induced by retinoic acid (RA) and brain derived neurotrophic factor (BDNF). Recent studies demonstrate that active protein kinase B (Akt) increased the protein levels of mash1 and increased its transactivation activity demonstrating that mash1 was required for Akt-induced GABAergic differentiation from neuronal precursor cells (NPC). In this study, we hypothesized that mouse embryonic carcinoma stem cells are differentiated into GABAergic neuron without stromal cells in the condition of RA and BDNF. First, we determined embryonic carcinoma line, F9 cells differentiated into GABAergic neurons on stromal cells. Secondly, we found that the expression of GABAergic neuronal marker increased at differentiation day 6, using western blot and RT-PCR. Third, to determine the effect of Akt modification in early GABAergic differentiation, we treated Akt inhibitor or activator at differentiation on day 5 for 24hr. These data suggest that the early GABAergic differentiation from the embryonic carcinoma cells can be induced by BDNF, RA and Akt signaling molecules.