pB1인공펩티드 유도 단클론 항체의 Apo B-100에 대한 에피토프 결정

Abstract

비만은 과잉으로 지방을 섭취함으로 에너지원으로 소비되고 남은 잉여분이 말초 조직에 저장되어 유발 되는 대사성 질환으로 그 치료와 예방에 있어 많은 노력과 사회적 비용이 소요되고 있다. 이런 비만은 지방질 대사에 있어서 low density lipoprotein (LDL)이나 very low density lipoprotein (VLDL)의 대사 이상과 밀접한 관련을 갖고 있는 고지혈증, 동맥경화증 및 심근경색 등의 순환계 질환 등을 동반질환으로서 야기시키는 질병으로 규정되어 있다. 혈액 중의 중성지방와 콜레스테롤 운반 수단의 하나인 LDL은 간이나 각 조직에 발현되는 LDL 수용체에 결합하여 지방성분들을 전달하며, 이때 apolipoprotein B-100 (Apo B-100)은 LDL receptor와 결합하는 리간드로 작용한다. 본 연구진의 선행연구에서 LDL의 주요 단백질인 Apo B-100이 LDL 수용체에 결합하는 것을 차단하면 비만이 억제 되는 것을 확인하였다. Apo B-100의 C-말단부위의 구조적 항원 결정기에 대한 mimetic 에피토프인 펩티드 pB1을 실험동물에 면역주사하면 유도되는 anti-pB1 항체가 LDL이나 VLDL에 있는 Apo B와 결합하여 지방이 조직으로 흡수 및 축적되는 것을 저해하여 비만을 억제하는 것으로 확인되었다. 본 연구는 Apo B-100의 mimetic 펩티드인 pB1이 교차반응하는 Apo B-100의 항원 결정기 부위를 규명하는 것을 목적으로 pB1특이적 단클론 항체를 유도 생산하고, 정제한 단클론 항체와 Apo B-100의 임의의 부분적인 분해에 의한 펩티드 조각을 작성하여 면역침전법으로 확인하여 Apo B-100에서의 교차반응성 항원 결정기를 규명하고자 하였다. pB1-특이적 단클론 항체는 Balb/C mouse에 B4T를 면역 접종하여 작성하였으며, hybridoma 클론은 펩티드 pB1에 대한 특이성을 ELISA로 분석하여 선별하였다. 단클론 항체 생산 hybridoma 세포주를 Balb/C 마우스에 복강주사한 후 채취한 복수로부터 protein A column chromatography에 의해 항체를 대량 생산하였다. 복수로부터 정제된 항체는 IgG1 및 IgG2b isotype 이었다. Apo B-100의 펩티드 조각는 두 가지 방법으로 작성하였다. 첫 번째 방법은 human serum으로부터 ultra-centifuge를 이용해(40,000 rpm≥ 2Ohours) LDL을 분리정제하고, LDL의 지지체로서의 Apo B-100이 지방을 포집하고 있는 소수성의 core영역 부분과 표면부위에서 수용체 혹은 항체와 결합하도록 노출된 친수성 부분으로 구성되어 있으므로, 정제한 LDL 그 자체를 트립신을 포함한 protease 복합효소로 digest시킨 후 Sephadex G-50을 이용한 size exclusion chromatography에 의해 surface-outer soluble peptide fragment를 분리 정제하여 농축하였다. Chromatographic eluent fraction을 SDS-PAGE로 확인한 결과 core부분의 펩티드는 void volume에서 회수되어 효율적으로 surface exposed peptide fragment를 확보할 수 있었다. 두 번째 방법은 정제된 단순히 Apo B-100 단백질을 트립신을 포함한 protease 복합효소로 분해시킨 후 농축시켰다. 이상에서 준비된 Apo B-100 펩티드 조각을 각각 정제한 단클론 항체와 반응시킨 후 Protein A magnetic beads system을 이용한 면역침전 반응을 유도한 후 magnetic recovery를 통해 immune mixture를 획득하였다. 회수된 immune complex를 SDS-PAGE전기영동 후 PVDF membrane에 transfer시킨다. 이 후 침전된 약 28 KDa의 단백질 밴드를 N-terminal 서열분석을 수행하여 7 개의 아미노산 서열(Gln-Val-Leu-Met-Thr-Gln-Thr)을 결정하였다. 그러나 부분적으로는, Apo B-100의 2355번째와 1268번째 서열에서 각각 4개(Gln-Val-Leu-Met), 3개(Thr-Gln-Thr) 아미노산서열이 존재하였다. 이 부위는 Apo B-100부분의 Core 부분에 해당하며, 하나의 펩티드가 두 부분으로 나뉘어질 수는 없기 때문에, 목적하였던바 pB1항체가 인식하는 Apo B-100의 교차반응성 에피토프의 확인은 달성하지 못하였다. 더구나, 본 아미노산 서열은 mouse IgG 경쇄 가변 부분의 CDR1의 앞부분에 위치하는 프레임워크에서 확인되었다. 본 연구를 통해 항체가 결합하는 부위는 protease에 의해서 쉽게 절단되었기 때문에 에피토프 부분이 훼손되었을 가능성이 매우 높은 것으로 생각되며, 따라서 특정 단백질의 항원 결정기를 탐색하고자 할 때에는 항원 단백의 protease 분해에 선행하여 항원 단백을 알킬레이션 등을 시킴으로 epitope 보호을 시킨 다음에, 또는 항체와 Apo B-100의 우선 결합 시킨 다음에 mild조건에서의 protease 분해를 수행하는 방법을 사용하거나 혹은 protease 분해 대신에 항원 단백질의 순차적 펩티드 조각 라이브러리를 사용하는 방법 등이 요망된다.