MCS-C2의 전립선암 LNCaP 세포에서의 안드로겐 수용체 의존적인 p21 CIP1 발현 증가에 의한 역설적 세포사멸 유도

Abstract

남성호르몬 안드로겐은 뼈와 근육의 형성 및 성장 등 다양한 생리학적 반응을 조절하며, 이러한 생물학적 반응은 안드로겐에 의한 안드로겐 수용체의 활성화를 통해 이루어진다. 안드로겐 수용체는 대표적인 핵 수용체로서 세포질에서 안드로겐과의 결합으로 활성화되어, 핵으로의 이동이 이루어지며 관련 유전자의 발현을 조절하게 된다. 전립선암은 남성의 경우 전 세계적으로 두 번째로 높은 발병률과 사망률을 보이는 질병이다. 이러한 전립선암의 발생과 진행의 가장 주요 원인은 안드로겐 수용체로서 초기 전립선암의 치료는 안드로겐 수용체의 활성을 억제하는 내분비 요법이 가장 효과적이며 우수한 치료 방법으로 알려져 있다. MCS-C2는 세포주기 억제물질인 sangivamycin을 모체로 합성한 pyrrolo[2,3-d]pyrimidine계열의 유도체로써 세포주기 조절 억제와 항암활성을 갖는 것으로 보고되어 있다. 본 연구에서는 안드로겐-의존적인 전립선암 LNCaP 세포에서 농도-특이적 세포사멸을 유도하는 MCS-C2의 작용기전을 알아보고자 하였다. MCS-C2의 항암활성 효과를 알아보기 위해 MTT assay, real time-Cell Electronic SensingTM (CESTM), Western blots을 통해 다양한 암세포 HL-60, PA-1, HeLa 세포에서 농도-의존적인 성장 억제, 세포사멸 주요 인자 caspse-9, -3의 활성과 DNA repair enzyme인 PARP의 불활성을 확인하였다. 그러나 안드로겐-비의존적인 전립선암 DU145 및 PC-3 세포에서는 세포성장 억제 및 세포사멸 유도가 발생되지 않음을 확인하였다. 반면, 흥미롭게도 안드로겐-의존적인 전립선암 LNCaP 세포에서는 DU145 및 PC-3 세포와 같은 안드로겐-비의존적인 전립선암세포와 달리 6 �M에서 농도-특이적 세포성장 억제와 세포사멸이 유도되지만, 그 보다 낮거나 (3 �M) 높은 농도 (12 �M) 에서는 세포성장 억제와 세포사멸 현상이 발생하지 않음을 확인하였다. 이러한 농도-특이적 세포사멸은 real-time PCR, Western blots과 p53 siRNA를 이용해 MCS-C2 6 �M 처리 시, p53-독립적인 p21CIP1의 과발현과 이러한 과발현에 의해 농도-특이적 세포사멸이 발생함을 확인하였다. 또한 PI staining을 통해 과발현된 p21CIP1은, 이미 잘 알려진 바와 같이 cyclin-dependent kinase inhibitor로써 세포주기 조절 억제 역할이 아닌, 세포사멸의 발생을 유도함을 확인하였으며, 세포면역염색을 통한 confocal 분석으로 MCS-C2 6 �M 처리 시 안드로겐 수용체가 활성화되어 핵으로 완벽히 이동한 것을 확인하였다. 또한, 전립선암 LNCaP 세포의 배양 시, 안드로겐을 제거한 상태에서 MCS-C2, 안드로겐 수용체 억제제인 Flutamide 그리고 안드로겐 (DHT)의 처리 등에 의한 다양한 조합을 통해 p21CIP1 및 세포사멸 인자들의 발현 양상을 확인하였다. 그 결과, MCS-C2 6 �M과 안드로겐 (DHT)을 모두 처리한 군에서는 p21CIP1의 과발현과 세포사멸인자의 활성화를 확인하였으며, 이러한 현상은 흥미롭게도 안드로겐 수용체 억제제인 Flutamide 처리 시 소멸되는 것을 확인하였다. 결론적으로, MCS-C2는 다른 암세포에서의 경우에 확인된 농도-의존적 세포사멸 유도와는 달리, 안드로겐-의존적인 LNCaP 세포에서 농도-특이적인 세포사멸을 유도하며, 이러한 현상은 p53-비의존적인 p21CIP1의 과발현에 의해 발생된다는 사실을 확인하였다. 또한 p21CIP1은 MCS-C2에 의해 안드로겐 수용체의 활성화 및 핵으로의 이동을 통해 발현하며, 이 p21CIP1은 안드로겐 수용체 의존적인 LNCaP 세포에서 농도- 특이적 세포사멸을 유도함을 확인하였다. 또한, 본 연구를 통하여 안드로겐-의존적 전립선암에서 MCS-C2의 새로운 개념의 항암제로서의 가능성을 제시하였다.; Androgens regulate numerous physiological responses from male sexual development to bone and muscle growth. The biological action of androgens is mediated through an androgen receptor (AR), a ligand-dependent transcription factor that belongs to the nuclear receptor superfamily. Prostate cancer is the most commonly diagnosed malignancy and the second leading cause of male cancer death in most western countries. Prostate cancer development and progression are dependent upon AR function and first-line treatment for metastatic disease is designed to specifically inhibit AR activity. In the course of screening for a novel cell cycle inhibitor, an analogue of the pyrrolo[2,3-d]pyrimidine nucleoside was synthesized and designated as MCS-C2. The present study investigated the antineoplastic potential and mode of action of paradoxical apoptotic induction by 6 �M MCS-C2 in androgen-dependent and androgen-sensitive prostate cancer LNCaP cells. MCS-C2 induced cell growth inhibition and apoptosis in a time- and dose-dependent manner in various non-prostate cancer cells, such as HL-60, PA-1 and HeLa cells. In contrast, MCS-C2 showed no apoptotic induction in androgen-independent prostate cancer cells, including DU145 and PC-3 cells. Interestingly, however, MCS-C2 showed a dose-specific paradoxical apoptotic induction in 6 �M MCS-C2-treated LNCaP cells, an androgen-dependent prostate cancer cells, while weakly inducing apoptosis at 3 and 12 �M MCS-C2. To investigate the molecular mechanisms involved in this paradoxical apoptotic induction by MCS-C2 in LNCaP cells, we performed real time-Cell Electronic SensingTM (RT-CESTM), Western blots, real time-PCR, and confocal microscopic analysis, as well as knocking-down using siRNA. Interestingly, paradoxical apoptotic induction was involved in dramatic up-regulation (46-fold) of p53-independent p21CIP1 expression in 6 �M MCS-C2-treated LNCaP cells. Accordingly, the present study indicated that this paradoxical apoptotic induction is associated with AR activation by 6 �M MCS-C2 and nuclear translocation of AR, which in turn resulted in up-regulation of AR-dependent p21CIP1 expression in LNCaP cells. Therefore, it has been concluded that AR-dependent and p53-independent p21CIP1 is a pivotal cell death inducer in 6 �M MCS-C2-treated androgen-dependent prostate cancer LNCaP cells.