AK5 단클론 항체의 작성과 생쥐 뇌에서의 AK5 유전자 발현 양상에 대한 연구

Abstract

Adenylate kinase (AK)는 원핵 세포에서 진핵 세포까지 모든 생명체에 광범위하게 존재하는 효소로, 인산기 전이 반응을 가역적으로 촉매 함으로써 ATP, ADP 및 AMP의 동적 평형을 이루며 에너지 대사와 핵산 합성 등에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 왔으나 최근의 연구결과 isozyme에 따라 moonlighting protein으로서 새로운 기능이 보고되고 있다. 생화학적으로 AK isozyme은 활성이 높고 세포질에 존재하는 short-form 과 활성이 매우 낮고 mitochondria에 존재하는 long-form으로 분류한다. AK1은 활성이 매우 높은 short form의 전형으로서, 뇌조직을 비롯한 거의 모든 세포에 존재하고 있다. 최근 뇌 조직특이적으로 또 다른 short form의 isozyme으로 AK5의 mRNA가 보고되었으며 유전자 재조합에 의해 발현, 정제한 AK5 효소 활성은 AK1의 1/10,000에 불과함이 보고되었다. 본 연구에서는 AK1에 비해 효소 활성이 상대적으로 매우 낮으며 아미노산 배열이 73%의 높은 상동성을 보이는 AK5에 대하여 뇌조직에서의 발현 양상을 조사함으로 AK5의 병태생리적 의의를 밝히는 기초를 제공하고자 하였다. 사람의 AK5 유전자를 E.coli 발현 vector에 subclonig 하여 재조합 AK5(hAK5)의 발현벡터를 구축하였으며, 이로부터 유전자 재조합 AK5 (hAK5)를 대량 확보하였다. hAK5의 효소 활성은 0.4 U/mg이었으며, ATP, ADP 및 AMP에 대한 Km값은 각각 209, 58, 및 608 μM이었다. 정제한 hAK5 단백질을 Balb/c 생쥐에 접종하여 단클론 항체를 생산하는 hybridoma cell line을 제작하여 AK5 특이적인 IgG1 및 IgG2b isotype의 단클론 항체 5개 클론을 확립하였다. AK5의 생쥐 뇌에서의 발현 여부 및 부위특이적 발현 양상을 확인하기 위해 Balb/c 생쥐의 뇌를 microdissection하여 6 개의 영역으로 구분한 후, total RNA와 단백질을 추출하였다. 얻어진 total RNA로는 reverse transcriptional PCR (RT-PCR)을 실시하여 각 영역별 AK5의 mRNA를 정량적으로 비교하였다. 그 결과는 hippocampus에서 가장 높은 농도로 존재함을 밝혔으며, 이는 cerebellum보다 약 19배 높은 수준이었다. 한편, 생쥐 뇌의 영역별로 추출한 단백질은 단클론 항체 28F5를 이용해서 western blot을 실시한 결과 모든 영역에 대하여 AK5의 발현을 확인하였다. 영역별 발현량은 hippocampus를 비롯한 다른 영역에 비해 cerebellum에서 특이하게 2~4배 더 높은 발현량을 보여 mRNA농도와는 다른 양상을 나타내었다. 또한, 뇌에서 발현하는 AK5는 2 분자량의 long variant와 단 분자량의 short variant의 2 종류의 variant들이 각각 발견되었으며, 이것은 최초에 보고된 2 종류의 mRNA가 발견된 것과 일맥 상통한다. 본 연구의 결과 AK5는 AK1과 별도로 뇌 조직에서 발현되고 있었으며, mRNA농도와는 무관하게 cerebellum에 특이하게 고농도로 발현하고 있었다. 또한 2 종류의 AK5 variants가 동시에 발현하고 있음을 밝혀냈다. 이러한 결과는 AK5는 AK isozyme으로서 AK1과는 다른 세포생리적 의미가 있음을 강력히 시사하는 바, 뇌 조직에 있어서의 AK5의 또 다른 병태 생리학적 검토가 요구된다.