AKmtSM(E122K)의 합성 및 NMR을 이용한 구조 연구

Abstract

Adenylate kinase(AK)는 ATP와 AMP사이에서 가역적 고에너지 인산화 작용을 촉매하여 ADP를 생성하는 효소(Mg?ATP + AMP ? Mg?2ADP)로서 에너지 물질대사와 nucleotide 합성에 관여한다. 진핵생물의 AK1과 Mycobacterium tuberculosis의 AK(AKmt)는 아미노산 서열에서 높은 상등성을 보이나, 활성에서는 AKmt가 AK1의 10%정도로 매우 낮다. AK1의 하전을 띤 아미노산이 효소활성 및 기질 친화도에 영향을 주는 것을 착안하여 유전자조합과 세포배양을 통해 AK1과 부분적으로 동일한 아미노산 서열을 갖도록 AKmt의 LID domain 중 음전하를 나타내는 Glu[122]를 양전하를 나타내는 lysine으로 변형시킨 단백질 생산하였다. SDS-Gelelectrophoresis와 Ni-chromatography를 이용하여 및 분리 정제하였으며 AKmt와 single mutant인 AKmtE122K의 활성을 비교한 결과 AKmtE122K가 2배 이상 높은 활성을 나타내었다. 아미노산의 서열분석, 화학적 이동, 구조결정을 위하여 1H,13C,15N-연관된 다핵다차원 HSQC, HNCA, HNCO , HSQC-TOCSY, NOESY NMR 실험 및 리간드 적정 실험을 수행하였으며, 단백질의 동력학적인 정보를 얻어내기 위하여 T1, T2, NOE 실험을 수행하였다. AKmt의 아미노산 서열 및 신호를 해석하고 AKmtE122K의 신호와 비교하였으며 얻어진 NMR 화학적신호를 이용하여 리간드 결합부위를 중심으로 결합상수 및 구조적인 변형 및 차이점을 알아보았다. LID domain 주위에 있던 V115∼D135 아미노산 잔기가 약 0.1∼0.3ppm정도의 화학적 이동이 변화를 관측하였다. T1, T2, NOE 이완 실험을 통해 P-loop와 Lid domain에 있는 아미노산 잔기들이 다른 아미노산 잔기들에 비해 운동성이 크다는 것을 알 수 있었다. 전체회전 상관시간의 평균값 τm을 측정하여 비교해본 결과 AKmtE122K가 AKmt보다 약 0.5 ns 차이가 있었으며 활성과 연관되어 있다는 것을 알 수 있었다. 효소의 촉매 메커니즘에서 loop나 domain의 움직임은 촉매 활성의 변화에 영향을 미친다. NMR을 이용하여 촉매 과정동안 ATP LID domain과 AMP binding domain의 구조적 재배치가 일어나 열림 형태에서 닫힘 형태로의 변화가 발생하는 사실을 관측하였다. ATP, AMP, Inhibitor 및 Mg이온의 적정실험과 NMR 실험분석을 통하여 해리상수 Kd값을 측정하였다. ATP의 농도를 AKmtE122K에 포화시켰을 때 ATP LID domain에서 약 0.5μM 결합이 AKmt보다 더 잘 이루어지면서 구조적 변화가 일어나는 사실을 알 수 있었다. AMP를 포화시키면 AMP binding domain에서 0.1μM 결합이 더 잘 이루어지면서 열림 형태에서 닫힘 형태로의 구조적 재배치가 일어남으로써 촉매활성에 변화가 일어난다는 것을 NMR 실험과 분자동력학 연구를 통하여 알 수 있었다.