Deinococcus radiodurans OxyR 단백질의 과산화물 감지 기작 연구

Abstract

OxyR은 세포 내 과산화물을 감지하는 전사조절인자로서 대장균을 모델 세균으로 가장 많은 연구가 이루어져 왔다. 대장균에 존재하는 OxyR (OxyREC)의 기존 연구 결과에 의하면 과산화수소를 감지하는 OxyR의 199번째 시스테인 잔기 (Cys199)는 먼저 sulfenic acid 형태 (R-SOH)의 intermediate 구조를 취하고, 이후에 208번째 시스테인 (Cys208)과 이황화 결합을 이루어 변화된 단백질 구조에 기인된 활성을 획득하게 된다. 활성화된 OxyR 단백질은 katG와 같은 조절 대상 유전자의 전사를 조절하게 된다. OxyR 단백질의 산화된 형태와 환원된 형태 모두조절 대상 유전자의 프로모터 부위에 결합은 하지만,활성을 획득한 산화된 형태의 OxyR이 RNA 중합효소와 상호작용에 의해 유전자 발현을 촉진한다고 알려져 있다. 본 연구에서 다루고자 하는 Deinococcus radiodurans내에는 기존에 알려진 OxyREC 단백질과 아미노산 서열상으로 비슷한 두 단백질이 존재한다고 생각 된다. D. radiodurans내에는 2개의 염색체가 존재하는데, 최근에 밝혀진 게놈 서열을 통해 염색체마다 각각 한 종의 oxyR 유전자 (dr0615과dra0336)가 존재하며, 이들을 OxyR1DR과 OxyR2DR라고 선행 연구에 의해 명명되었다. 아미노산 서열 분석을 통해, 이 두 OxyR 단백질들은 OxyREC에서 과산화수소를 감지하는 역할을 하는 Cys199 (Peroxidatic cysteine)에 상응하는 시스테인은 존재하지 않고, 이 시스테인이 산화가 되었을 때 이황화 결합을 이루는 Cys208 (Resolving cysteine) 위치에만 시스테인 잔기가 보존되어 있는 것으로 나타났다. 이를 통해 D. radiodurans OxyR 단백질들은 대장균에 존재하는OxyR이 과산화수소를 감지한 후에 분자 내 이황화 결합 (intramolecular disulfide bond)을 이룬다는 기존에 연구결과와는 같은 결과를 수반할 수 없는 특이적인 과산화물 감지 메카니즘을 이용할 것을 암시해 주고 있다. 실제 SDS-PAGE 분석 실험을 통해 wild type OxyR1DR의 경우 mutant OxyR1DR (C210S)과는 다르게 과산화수소에 의해 산화되어 dimer를 형성한 크기에 해당하는 band를 확인하였는데, 고농도의 과산화수소는 이러한 band 형성을 강화 시키는 것을 확인하였다. 최종적으로 MALDI-TOF 질량분석 기법을 통해 이 band의 Cys210이 포함된 펩타이드는 IA에 의해 alkylation되지 않음을 확인할 수 있었다. 이를 통해, 두 분자의 OxyR1DR 단백질이 해당 시스테인 잔기를 이용해 분자 간 이황화 결합 (intermolecular disulfide bond)을 이룬다는 결론을 얻을 수 있었다. 흥미롭게도 이러한 현상은 D. radiodurans 세포 내에서 발현시킨 OxyR1DR 단백질에서도 나타났는데, in vitro 실험 결과와 같이 과산화수소를 처리하지 않거나 1 mM 수준의 과산화수소를 처리한 세포 내 OxyR1DR에 대한 dimer 형성능력에 차이가 나타나지 않았다. 이러한 결과를 통해 OxyR1DR는 Cys210 잔기를 이용하여 고농도의 과산화수소를 감지하여 반응을 나타낸다고 생각된다. 본 연구는 기존에 보고된 OxyR1DR의 Cys210 잔기가 과산화수소를 감지하여 sulfenic acid (R-SOH)형태로 활성을 띈다는 내용이 아닌 OxyR1DR 분자끼리 이황화 결합을 통한 homodimer 형태를 이루어 기능을 한다는 것으로써, 기존에 알려진 OxyR 단백질의 작용 메커니즘과는 다른 과산화물 감지기작을 제시해 준다. |OxyR, an intracellular peroxide sensing regulator, has been intensively studied using model organism, Escherichia coli. According to previous studies on E. coli OxyR (OxyREC), a thiol residue of Cys199 initially oxidized to a sulfenic acid intermediate (R-SOH) upon exposure to hydrogen-peroxide, which then forms a intramolecular disulfide bond with Cys208 resulting in active conformation. This activated OxyR upregulates target genes such as katG and grxA, which are involved in defense against oxidative stress. Although both the oxidized and reduced OxyR can bind promoter regions of target genes, the oxidized OxyR can only increase the expression of target genes through interaction with RNA polymerases. In this study, two putative OxyR proteins from Deinococcus radiodurans which exhibit similarity with OxyREC were investigated. D. radiodurans has two distinct chromosomes and each has one oxyR gene, dr0615 or dra0336 which encode different OxyR protein named as OxyR1DR or OxyR2DR respectively. Those proteins do not have a cysteine residue corresponding to peroxidatic cysteine of Cys199 in OxyREC, but have a conserved cysteine residue corresponding to resolving cysteine of Cys208 which can react with initially oxidized Cys199 by disulfide formation. These indicate that the peroxide sensing mechanism of the two D. radiodurans OxyR proteins may not be same with that of OxyREC which forms intramolecular disulfide bond upon hydrogen peroxide sensing. Indeed, SDS-PAGE analyses showed that wild type OxyR1DR could form a homodimer by intermolecular disulfide bond at both low and high concentration of hydrogen peroxide, but mutant OxyR1DR (C210S) could not. Furthermore, MALDI-TOF MS analysis revealed that the disappearance of tryptic peptide containing Cys210, indicating that Cys210 residue is involved in intermolecular disulfide bond formation. Dimer formation of OxyR1DR was also observed with in vivo experiment using D. radiodurans cells harboring FLAG-epitope tagged OxyR1DR. All these results suggest that D. radiodurans OxyR may use intermolecular disulfide bond formation unlike OxyREC which uses intramolecular disulfide bond formation for the sensing of peroxide; OxyR, an intracellular peroxide sensing regulator, has been intensively studied using model organism, Escherichia coli. According to previous studies on E. coli OxyR (OxyREC), a thiol residue of Cys199 initially oxidized to a sulfenic acid intermediate (R-SOH) upon exposure to hydrogen-peroxide, which then forms a intramolecular disulfide bond with Cys208 resulting in active conformation. This activated OxyR upregulates target genes such as katG and grxA, which are involved in defense against oxidative stress. Although both the oxidized and reduced OxyR can bind promoter regions of target genes, the oxidized OxyR can only increase the expression of target genes through interaction with RNA polymerases. In this study, two putative OxyR proteins from Deinococcus radiodurans which exhibit similarity with OxyREC were investigated. D. radiodurans has two distinct chromosomes and each has one oxyR gene, dr0615 or dra0336 which encode different OxyR protein named as OxyR1DR or OxyR2DR respectively. Those proteins do not have a cysteine residue corresponding to peroxidatic cysteine of Cys199 in OxyREC, but have a conserved cysteine residue corresponding to resolving cysteine of Cys208 which can react with initially oxidized Cys199 by disulfide formation. These indicate that the peroxide sensing mechanism of the two D. radiodurans OxyR proteins may not be same with that of OxyREC which forms intramolecular disulfide bond upon hydrogen peroxide sensing. Indeed, SDS-PAGE analyses showed that wild type OxyR1DR could form a homodimer by intermolecular disulfide bond at both low and high concentration of hydrogen peroxide, but mutant OxyR1DR (C210S) could not. Furthermore, MALDI-TOF MS analysis revealed that the disappearance of tryptic peptide containing Cys210, indicating that Cys210 residue is involved in intermolecular disulfide bond formation. Dimer formation of OxyR1DR was also observed with in vivo experiment using D. radiodurans cells harboring FLAG-epitope tagged OxyR1DR. All these results suggest that D. radiodurans OxyR may use intermolecular disulfide bond formation unlike OxyREC which uses intramolecular disulfide bond formation for the sensing of peroxide