Genome Resource-based Molecular and Environmental Biological Research in Aquatic Organisms

Abstract

Intertidal copepod, Tigriopus japonicas; Monogonont rotifer, Brachionus orientalis; Rockshell, Thais clavigera; Sea urchin, Strongylocentrotus droebachiensis; Polychaete, Perinereis nuntia; Hermaphroditic fish, Kryptolebias marmoratus), library was constructed and randomly sequenced using several NGS methods (GS-20, GS-FLX, and Solexa) as Next Generation Sequencing (NGS) flatforms. After trimming and cleaning process of raw sequence data, extensive contigs/singletons for each organism were acquired in assembly stages. To identify potential biomarkers in each organism, assembled consensus sequence were annotated with the NR (non-redundant) amino acid sequence database reserved in NCBI using BLASTX. Of the unigenes obtained in each species, a number of stress- and cellular defense-related genes (e.g. heat shock protein family, antioxidant-related genes, cytochrome P450 superfamily, immune system-related genes, DNA repair-related geens) were found that are potentially useful for aquatic environment monitoring at the molecular level, indicating that the NGS method is an effective approach to uncover gene families of potential biomarker genes simultaneously, and thus make transcriptomic studies possible. To confirm the usefulness of those potential biomarker genes, comparative transcript profiles of each organism were analyzed using several molecular and biochemical approaches, such as quantitative real-time RT-PCR, PCR array, and oligochip, upon exposure to diverse environmental changes, chemicals, and pollutants. In this study, the gene/genome information of seven aquatic organisms was summarized and discussed its potential use in environmental genomics and ecotoxicological studies for uncovering the potential molecular mechanisms of environmental stresses and chemical toxicity to the non-model indicator species in aquatic environment. |산업화 및 공업화의 첨단화에 따른 다양한 신생 화학물질들의 개발과 현대 산업의 근간을 이루는 화합물들의 사용은 인류 및 생태계에 극심한 환경오염문제를 야기시키고 있으며, 자연 환경의 자정능력 이상으로 유입된 오염물질들에 의한 생태계의 파괴가 광범위하게 급속도로 진행되고 있다. 다양한 생태계 환경 가운데 수서 생태계는 육상 생태계로부터 생성된 오염 물질의 주된 유입 경로이며, 오염물질의 종류와 양 및 특성에 따라 여러 형태의 직·간접적인 문제들을 일으킨다. 수서 생태계의 오염은 환경 오염 물질들이 단순히 생산자나 1 차 소비자에 해당되는 생물군에 독성을 나타내거나 그들의 체내에 축적되는 것이 아니라, 먹이사슬을 통해 상위 소비자의 체내에 농축됨으로써 더 큰 독성 영향을 나타낼 수 있다. 따라서 먹이사슬 내 하위 생산자와 상위 소비자 생물종들을 이용한 수서 생태계 환경 오염 연구는 환경 오염 물질들이 생태계에 미치는 영향을 빠르게 파악하는데 용이하다. 환경 오염 물질들에 의해 야기될 수 있는 생물체에 미치는 영향 분석의 일환으로 해양 및 육상의 수환경 생태계내에서 외부 환경에 민감히 반응하여 계절적으로 생산량 변동이 큰 생산자와 소비자 사이에 에너지 흐름을 연결해 줄 생물군의 선택이 필요하다. 본 연구에서는 수서 생태계 내 먹이사슬의 각 계층에 해당하는 주요 생물종들을 선택하여, 대상 종들의 유전 정보를 바탕으로 다양한 환경 변화에 따른 유전자 혹은 유전자군의 발현을 분석하였다. 인간 게놈의 해독으로 인해 다양한 생물종의 유전체 및 유전 정보가 기하급수적으로 밝혀지고 있으며, 이와 더불어 유전체를 해독하는 기술들도 날로 발전하고 있다. 기존 EST (expressed sequence tag)를 이용하여 유전 정보를 확보하는 방법은 노동 및 시간 집약적이었던 반면, 차세대 유전체 해독기술 (Next Generation sequencing)을 이용한 방법은 적은 양의 cDNA/gDNA 를 이용하여, 단시간 내 많은 수의 유전 정보를 확보할 수 있는 큰 장점이 있다. 또한 첨단 bioinformatics tool 들의 발전으로 상기 방법을 이용하여 얻은 유전 정보로부터 중요한 유전자들의 annotation 이 가능해졌으며, 대량의 유전자군을 단시간 내 손쉽게 확보하여, 이를 분자생물학, 생화학, 의학, 진화학, 발생학, 환경학, 독성학 및 다양한 순수 과학들과 접목을 할 수 있게 되었다. 본 연구에서는 유전 정보의 확보와 환경 감시를 위한 모델종을 발굴하기 위하여, 남조류 (cyanobacteria, Microcystis aeruginosa), 윤충류 (monogonont rotifer, Brachionus orientalis ), 요각류 (intertidal copepod, Tigriopus japonicas), 성게류 (sea urchin, Strongylocentrotus droebachiensis), 복족류 (rockshell, Thais clavigera), 다모류 (polychaete, Perinereis nuntia), 어류 (hermaphroditic fish, Kryptolebias marmoratus) 각 1 종으로부터 RNA 또는 gDNA 를 추출한 후, library 를 제작하여 sequencing 을 수행하였다. Raw data 의 assembly 후 NR-BLASTx 를 이용하여 전체 read 에 대한 annotation 을 수행하였으며, 확보한 유전 정보를 이용하여 internal local blast 기능을 갖춘 각 생물종의 유전자 및 단백체 database 를 수립하였다. 또한 각 생물종의 유전 정보로부터 환경 오염 감시에 적합한 유전자 또는 유전자군을 특성에 따라 선별하였으며, genome walking PCR, RACE, cloning 및 sequencing 등 기본 분자생물학 방법들을 이용하여 개개의 유전자들을 정확하게 분석하였다. 생물체 및 그들의 유전 정보를 이용하는 환경 연구에 있어 대상 생물종의 선별은 매우 중요하다. Field 에서 영향 평가가 가능함과 동시에 연구실 내에서 그 line 이 안정적으로 유지되는 종을 선별하여야 환경 연구에 유용한 유전자 및 단백질들을 발굴할 수 있으며, 이들을 이용한 군집 및 세대간의 영향 평가가 가능하다. 이에 따라 상기 종들 가운데 세대간 간격이 비교적 짧으며, 연구실 환경내에서 안정적으로 군집이 유지되고, mammalian cell 을 대상으로 사용되어 온 다양한 in vivo/in vitro 실험 기법의 도입을 시도할 수 있는 윤충류, 요각류, 어류를 선별한 후 이들을 심도있게 연구하기 위해 추가적으로 전체 게놈 sequencing 을 수행하였다. 확보한 유전 정보를 바탕으로 각 생물종으로부터 potential biomarker 유전자를 발굴하기 위해 온도 변화, UV 변화 등 기본적인 환경의 조건 변화들 및 중금속, 내분비장애물질, pharmaceutical, 항생제 등 환경오염물질들에 노출한 후 대상 생물종의 특성에 맞게 RT-PCR, realtime PCR, PCR array, microarray 등 몇몇 genomics tool 들을 이용하여 유전자 및 유전자군의 발현 양상을 분석하였다. 분석 대상 유전자들은 일반적인 환경스트레스, 산화적 스트레스, 화학물질에 의한 독성, DNA damage 로부터 세포를 보호하기 위한 heat shock protein (hsp), cytochrome P450 superfamily (CYP450), glutathione-related gene family, DNA repair-related gene family 등을 선정하였으며, 상기 대상 생물종들에서 환경의 변화 및 환경 오염 물질 노출에 대한 각각의 발현 양상을 분석하였다. 또한 내분비장애물질의 위해성 평가를 위해 점박이송사리의 HPG axis array 를 구축하였으며, 내분비장애물질 노출에 의한 hormone 및 성 분화 관련 유전자들의 발현을 분석하였다. 이를 통하여 다양한 환경 변화에 따른 많은 수의 유전자들의 초기 발현이 변화하는 것을 측정하였으며, 이들 유전자군 가운데 특정 환경 변화에 따른 potential biomarker 유전자들을 각각의 종들로부터 발굴하였다. 본 연구에서는 차세대 유전체 해독기술 (Next Generation sequencing) 기법을 이용하여 다양한 수서 생물종으로부터 유전체 및 유전 정보를 확보하였으며, 환경 영향 평가에 사용될 수 있는 활용법을 분석하였다. 현재까지 model 생물종을 대상으로 적용되어 오던 첨단 분자생물학 기법들은 점차 non-model 생물종들을 대상으로 시도되고 있으며, 이러한 동향에 더하여 대량의 유전 정보를 단 시간 내 확보하여 환경 영향 평가에 사용될 수 있는 연구 방법 및 적용 결과들을 본 연구 결과에서 제시하였다. 또한 model 생물종들에서 기능이 밝혀진 marker 유전자들을 non-odel 생물들의 동정된 유전자와 비교·분석함으로써 다양한 non-model 생물들의 유전 정보의 활용성을 제시하였다. 이를 통해 특정 유전자 또는 유전자군에 의한 환경 오염의 조기 경보 시스템을 다양한 생물체들의 유전 정보로 구축할 수 있으며, 나아가 non-model 생물종들의 유전 정보를 이용하여 수서 환경 연구뿐만 아니라 다양한 분야의 첨단 유전체, 단백체 및 대사체 연구에 활용할 수 있으리라 사료된다.; Understanding the biological effects of exposures to diverse chemicals in the aquatic ecosystem relies on recently developing and emerging genomics technologies in the omics area. Although several developed techniques and advanced technologies have been applied in toxicological investigation with model organisms for a long time, gene information and fuctional characteristics for non-model organisms have been recently studied using several potential model organisms. To establish linkages between aquatic non-model organisms and newer omic technologies, gene/genome information of several aquatic organisms was constructed by Next Generation Sequencing (NGS) method. The challenges of the individual usages of gene/genome information and the combinations of molecular tools for environment monitoring were discussed in application to aquatic ecotoxicogenomics with a particular emphasis on the non-model organism testing. In this study, gene/genome information of several aquatic non-model organisms was obtained by the NGS method and annotated to utilize them as a test organism for aquatic environment monitoring studies. From the total RNA and/or genomic DNA of seven aquatic organisms (Cyanobacteria, Microcystis aeruginosa NIES-298; Hermaphroditic fish, Kryptolebias marmoratus), library was constructed and randomly sequenced using several NGS methods (GS-20, GS-FLX, and Solexa) as Next Generation Sequencing (NGS) flatforms. After trimming and cleaning process of raw sequence data, extensive contigs/singletons for each organism were acquired in assembly stages. To identify potential biomarkers in each organism, assembled consensus sequence were annotated with the NR (non-redundant) amino acid sequence database reserved in NCBI using BLASTX. Of the unigenes obtained in each species, a number of stress- and cellular defense-related genes (e.g. heat shock protein family, antioxidant-related genes, cytochrome P450 superfamily, immune system-related genes, DNA repair-related geens) were found that are potentially useful for aquatic environment monitoring at the molecular level, indicating that the NGS method is an effective approach to uncover gene families of potential biomarker genes simultaneously, and thus make transcriptomic studies possible. To confirm the usefulness of those potential biomarker genes, comparative transcript profiles of each organism were analyzed using several molecular and biochemical approaches, such as quantitative real-time RT-PCR, PCR array, and oligochip, upon exposure to diverse environmental changes, chemicals, and pollutants. In this study, the gene/genome information of seven aquatic organisms was summarized and discussed its potential use in environmental genomics and ecotoxicological studies for uncovering the potential molecular mechanisms of environmental stresses and chemical toxicity to the non-model indicator species in aquatic environment.