Raw264.7 세포 주에서 mTOR 매개 LPS 유도 TNF-α 발현 조절에 미치는 PLD의 역할 규명

Abstract

LPS에 의해 유도된 TNF-α 발현에 있어서 PLD의 역할을 알아보고자 하였다. LPS는 macrophage 세포주인 Raw 264.7 세포에서 TNF-α 발현을 증가시킨다고는 것은 이미 많이 보고되었고 본 실험에서도 LPS 처리시 TNF-α 발현이 증가되는 것을 확인하였다. 따라서 LPS에 의해 유도된 TNF-α 발현에 PLD가 관여하는지 알아보기 위해 PLD의 발현과 활성도를 측정하였다. 그 결과 활성도가 증가하는 것을 확인했고, 여기서 PLD의 관련 여부를 알아보기 위해PLD siRNA를 transfection 했다. 흥미롭게도PLD2가 아닌 PLD1을 하향조절 했을 때 TNF-α의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었고, 이 결과로 인해 PLD1이 LPS에 의한 TNF-α 발현을 조절하는 조절 인자로 작용한다는 것을 알 수 있었다. 다음으로 PLD 하위에서 조절 받는 분자들로 mTOR-p70S6K, JNK, c-jun들이 조절 되는지 알아보았다. LPS 자극에 의해 p70S6K, JNK, c-jun의 인산화가 증가하였고, PLD를 하향조절 시켰을 때 인산화가 감소됨을 확인하였다. mTOR 억제제인 Rapamycin을 처리했을 때 JNK와 c-jun의 인산화가 감소하는 것을 확인하였고, 또한 JNK 억제제인 SP600125를 처리하였을 때도 c-jun의 인산화가 감소함을 확인하였다. 그 결과 PLD가 하위 분자들인 p70S6K, JNK, c-jun 신호전달 체계 조절에 중요한 조절인자로 작용함을 확인하고, 마지막으로 ChIP (Chromatin immunoprecipitation) assay를 통해 LPS에 의해 인산화된 c-jun이 TNF-α promoter region에 결합함을 확인하였다. 위 결과를 정리해보면, PLD가 LPS로 유도된 mTOR-p70S6K/JNK/c-jun signal pathway를 통해 TNF-α 발현에 중요한 조절인자로 작용함을 알 수 있었다.