SH-SY5Y 세포주에서 chlorpyrifos에 의해 유발된 자가소화작용과 세포자살관계에 관한 연구

Abstract

Recent studies have been shown that up-regulation of autophagy may be a tractable therapeutic intervention for clearing disease-causing proteins, including α-synuclein, ubiquitin, and other misfolded or aggregated proteins in pesticide-induced neurodegeneration. In a previous study, we reported that chlorpyrifos (CPF)-induced mitochondria-dependent apoptosis is mediated through reactive oxygen species in SH-SY5Y cells. In this study, we explored the mechanism of CPF-induced autophagy and a novel pharmacotherapeutic approach to prevent CPF neurotoxicity involving the regulation of autophagy. We found that CPF induced apoptosis in SH-SY5Y cells, as demonstrated by the activation of caspase-9, 3, PARP and nuclear condensation. In addition, we observed the cells treated with CPF undergo autophagic cell death by monitoring the expression of LC3-II, p62 and Beclin-1. Exposure of SH-SY5Y cells to CPF led to the production of ROS. Interestingly, Treatment with the antioxidant, N-acetyl-cysteine (NAC) effectively blocked apoptosis and autophagy. NAC treatment abolished MAPK phosphorylation caused by CPF, indicating that ROS are upstream signals of MAPKs. Furthermore, JNK and ERK inhibition reduced the CPF-induced expression of cleaved caspase-3 and LC3-II. However, p38 MAPK inhibition increased the expression of LC3-II and enhanced autophagy decreases the activation of cleaved caspase-3. In addition, pretreatment with the autophagy inducer, rapamycin significantly enhanced the cell viability of CPF-exposed cells, and the enhancement of cell viability was partially due to alleviation of CPF-induced apoptosis via a decrease in levels of cleaved caspase-3. Specifically, rapamycin pretreatment decreased Bax and increased Bcl-2 expression in mitochondria. In addition, rapamycin significantly decreased cytochrome c release in from mitochondria into the cytosol. However, pretreatment of cells with the autophagy inhibitor, 3-methyladenine (3MA), remarkably increased CPF toxicity in these cells; this with correlated with increased expression of Bax and decreased expression of Bcl-2 in mitochondria. Our results demonstrate the CPF-induced autophagy is involved in part through MAPK activation via ROS generation. p38 MAPK is a critical mediator of the balance between apoptosis and autophagy induced by CPF. Additionally, CPF-induced cytotoxicity is modified by autophagy regulation and rapamycin protects against CPF-induced apoptotic cell death by enhancing autophagy. Pharmacologic induction of autophagy by rapamycin may be a useful treatment strategy in neurodegenerative disorders.|산화스트레스(oxidative stress)는 노화를 비롯하여 세포의 죽음과 생존에 관련되어 있다는 많은 연구가 보고 되고 있으며 이러한 산화스트레스가 세포자살(apoptosis)뿐만 아니라 자가소화작용 (autophagy)과도 관련되어 있다는 연구 결과들이 보고 되고 있다. 또한, 현재 유기인제제 농약(pesticide)이 신경세포에서 활성산소종(ROS, reactive oxygen species)을 유발시켜 세포사멸을 유도한다는 연구결과들이 많이 보고 되고 있으며, 이러한 앞선 연구들의 결과를 바탕으로 본 연구에서는 Chlorpyrifos(CPF)를 이용하여 SH-SY5Y 세포주에서 oxidative stress의해 일어나는 apoptosis와 autophagy의 발현 메카니즘을 연구하고, autophagy와 apoptosis와의 상호작용 관계를 밝히는 연구를 진행하였다. 본 연구에서는 CPF에 의해 유발되는 ROS를 flow cytometry를 사용하여 측정하였고, 유도된 세포자살과 자가소화작용을 확인하기 위하여 세포자살 표식자(apoptosis maker)인 caspase-9, 3, PARP와 자가소화작용 표식자(autophagy marker)인 LC3-Ⅱ, p62, Beclin-1을 통해 확인하였다. 그리고 autophagy에 의한 apoptotic cell death의 관계를 알아보기 위해 자가소화작용 유도제(autophagy inducer)인 rapamycin과 자가소화작용 억제제(autophagy inhibitor)로 알려져 있는 3MA를 전 처리하여 세포의 생존율과 caspase-3 그리고 LC3-Ⅱ의 단백질 변화량을 관찰 하였다. 그리고 antioxidant인 N-acetyl-cysteine (NAC)와 각각의 MAP kinase 억제제(SP600125, U0126, SB203580)를 전 저리하고 CPF를 처리하여 ROS, MAP kinase와 autophagy의 상관관계를 관찰 하였다. 이러한 실험을 통하여CPF에 의해 cytotoxicity, apoptosis 그리고 autophagy가 유발되는 것을 확인하였고 NAC를 처리하여 apoptosis와 autophagy가 억제되는 것을 확인하였다. 또한, MAP kinase와 apoptosis 그리고 autophagy의 상관관계를 확인하기 위해 JNK, ERK, p38의 억제제인 SP600125, U0126, SB203580를 처리하고 cleaved caspase-3와 LC3-Ⅱ의 발현을 확인한 결과, MAP kinase 억제제를 처리한 세포에서 cleaved caspase-3의 발현이 줄어드는 것을 확인하였다. 하지만 p38의 억제제인 SB203580를 처리한 세포에서는 LC3-Ⅱ의 발현이 증가하였다. 이 결과를 통해 p38이 autophagy를 억제하며 p38을 억제 시 autophagy의 발현이 증가한다고 판단하였다. 또한, CPF에 의해 유도 되는 apoptosis와 autophagy 상호작용 관계에서 p38이 중요한 역할을 한다는 결과를 확인 할 수 있었다. 그리고 autophagy inducer인 rapamycin과 autophagy inhibitor인 3MA를 처리한 결과 rapamycin을 처리한 세포에서 apoptotic cell death가 감소하는 것을 확인 하였으며 3MA를 처리한 세포에서는 apoptotic cell death가 증가하는 것을 확인하였다. 이를 통해 autophagy에 의해서 apoptosis가 조절 된다는 결과를 확인하였다. 이상으로 본 연구에서는 SH-SY5Y세포주에서 ROS에 의한 MAP kinase의 발현이 autophagy와 apoptosis의 발현에 관여한다는 결과를 바탕으로 CPF에 의해 유도되는 autophagy와 apoptosis의 상호작용 관계를 밝혔으며, 이를 통하여 유기인제제에 의해 신경세포내 비정상물질이 침착 되어 발병하는 퇴행성 뇌 질환의 치료 및 예방에 도움을 줄 수 있을 것이라는 가능성을 제시 하려고 한다.; this with correlated with increased expression of Bax and decreased expression of Bcl-2 in mitochondria. Our results demonstrate the CPF-induced autophagy is involved in part through MAPK activation via ROS generation. p38 MAPK is a critical mediator of the balance between apoptosis and autophagy induced by CPF. Additionally, CPF-induced cytotoxicity is modified by autophagy regulation and rapamycin protects against CPF-induced apoptotic cell death by enhancing autophagy. Pharmacologic induction of autophagy by rapamycin may be a useful treatment strategy in neurodegenerative disorders.