Paracrine 기전을 통한 Foxa2와 Nurr1의 중뇌 도파민뉴런 보호효과

Abstract

Parkinson’ disease (PD) is regarded as an intractable disorder. Without fundamental therapeutic methods, medical treatment has been commonly done using L-DOPA, a precursor form of dopamine (DA). Current treatment methods have encountered various difficulties of their own. The nuclear receptor related 1 protein (Nurr1) and Forkhead box protein a2 (Foxa2) are the transcription factors of which specific roles in the development and maintenance of the midbrain dopamine(mDA) neurons have been suggested. I herein demonstrate that these factors determine the therapeutic roles in PD by protecting mDA neurons from toxic insults. I showed in this study that forced expression of Nurr1 and Foxa2 protect DA neurons derived from ventral midbrain tissues from toxic insults induced by the general oxygen free radical inducer H2O2 and the Parkinsonian toxin MPP+. Co-expression of Nurr1 and Foxa2 showed further dramatic effects on mDA neuron survival and resistance in a synergistic manner. Interestingly diffusible factors released from Nurr1+Foxa2-transduced astrocytes and neighboring non-dopaminergic neuronal cells exerted the protective roles, suggesting a paracrine mode of the Nurr1+Foxa2 actions. I further revealed that SHH, GDNF, BDNF, and NT3 are the responsible paracrine factors. Furthermore, levels of inflammatory cytokines such as TNFα, interleukin-1β released from glial cells were decreased by Nurr1+Foxa2 overexpression. This study is the first demonstration for the therapeutic potentials of Nurr1 and Foxa2 in PD, and thus can offer promise for the treatment of PD.|파킨슨병은 뇌의 흑색질(subtantia nigra)에 분포하는 도파민 신경세포가 한꺼번에 모두 없어지는 것이 아니라 점진적인 과정으로 진행되어 50~70% 정도까지 없어지면 임상 증상이 나타나 떨림, 경직및 자세 불안정성이 특징적으로 나타나는 만성 퇴행성 질환이다. 파킨슨병은 흑색질에서 기저핵의 기능을 조절하기 위하여 분비되는 물질인 도파민이 부족하면 나타나는 질환이기 때문에 이의 치료를 위해 현재 이용되고 있는 방법은 약물에 의해 도파민을 보충해주거나 그 작용들을 도와줄수 있는 것들이 대부분 일뿐 근본적인 치료방법이 될 수 없는 한계점이 있다. 이와같은 이유로 사상된 태아의 중뇌를 직접 뇌에 이식하거나 cell therapy의 목적으로 다양한 방법의 치료의 목적을 위한 접근이 있었지만 예후가 좋지 않았고 host와의 integration이 잘 되지 않아 graft형성에 문제점이 지적되어 왔다. 따라서 본 연구에서는 중뇌 도파민 뉴런을 실제의 세포죽음을 방지하는 것을 목적으로 개선점을 제시하고, 근본적인 파킨슨의 치료를 위해 도파민뉴런의 생존능력을 향상시키고 보호 할수 있는 전략으로 계획되었다. 도파민뉴런의 형성과 생존능력에 관계되는 gene들은 Lmx1a/b, otx2, Nurr1, Pitx3, Foxa2등 여러 가지가 알려져 있다. 그중에서도 우리가 초점을 맞춘 Foxa2와 Nurr1은 뇌의 발생단계에서뿐만 아니라 도파민뉴런의 생존에도 매우 중요하다. Nurr1은 중뇌 도파민뉴런의 분화 초기에서부터 adult까지 발현이 유지되고, 파킨슨질환에서 Nurr1이 점차 감소한다는것이 알려져 있다. 뿐만아니라 도파민뉴런의 성숙과정 동안 Nurr1의 결핍이 선조체(striatum)에서의 도파민을 급격히 감소시키고 뉴런의 소실에 관계된다고 보고 되어있다. Nurr1과 마찬가지로 Foxa2 또한 발생 초기 단계에서부터 중요한 역할을 하는 인자로서, Nurr1보다 전 단계에 발현되어 도파민뉴런의 생존과 유지에 필수적인 역할을 한다고 알려져 있다. 특히 최근에 Foxa2와 Nurr1이 공동작용을 통하여 도파민뉴런의 생존능력을 향상시킨다는 보고가 있었고, 도파민뉴런의 survival과 death에 midbrain의 factor로서 중요하다고 보고되고 있다. 이와같은 이유로 본 연구에서는 exogenous하게 Foxa2와 Nurr1을 도파민뉴런에 transduction하여 cell survival의 증대효과를 확인하고, 여러 독소들에 의한TH+ 뉴런의 세포죽음 방지효과를 확인하였다. 이중 TH positive한 cell이 transgene에 대해서 거의 GFP positive하지 않았음을 확인 하였는데 이는 Foxa2와 Nurr1의 intrinsic effect보다도 survival effect가 neuronal cell에 의한 extrinsic effect의 가능성을 제시하여 준다. 우리는 neuronal cell뿐만이 아니라non-neuronal cell중에서 brain에서 높은 비율을 차지하고 있는 astrocyte에 focus를 맞추어 실험을 진행함과 동시에, extrinsic effect의 확인을 위해 co-culture방법과 conditioned media의 효과를 입증하였다. 또한 Nurr1과 Foxa2에 의한 염증억제로 인한 도파민뉴런의 생존증가의 가능성을 확인하였으며, Foxa2와 Nurr1에 의한 survival 관련 gene인 SHH, GDNF, BDNF, NT-3등 다양한 neurotrophic factor들의 발현양상을 확인하여 상승효과를 검증하였고, MPTP mouse model에서 cell survival이 향상됨을 아울러 확인하였다. 이로인해 Nurr1과 Foxa2의 치료적목적을 위한 도입의 가능성을 제시하게 되었다.; Parkinson’ disease (PD) is regarded as an intractable disorder. Without fundamental therapeutic methods, medical treatment has been commonly done using L-DOPA, a precursor form of dopamine (DA). Current treatment methods have encountered various difficulties of their own. The nuclear receptor related 1 protein (Nurr1) and Forkhead box protein a2 (Foxa2) are the transcription factors of which specific roles in the development and maintenance of the midbrain dopamine(mDA) neurons have been suggested. I herein demonstrate that these factors determine the therapeutic roles in PD by protecting mDA neurons from toxic insults. I showed in this study that forced expression of Nurr1 and Foxa2 protect DA neurons derived from ventral midbrain tissues from toxic insults induced by the general oxygen free radical inducer H2O2 and the Parkinsonian toxin MPP+. Co-expression of Nurr1 and Foxa2 showed further dramatic effects on mDA neuron survival and resistance in a synergistic manner. Interestingly diffusible factors released from Nurr1+Foxa2-transduced astrocytes and neighboring non-dopaminergic neuronal cells exerted the protective roles, suggesting a paracrine mode of the Nurr1+Foxa2 actions. I further revealed that SHH, GDNF, BDNF, and NT3 are the responsible paracrine factors. Furthermore, levels of inflammatory cytokines such as TNFα, interleukin-1β released from glial cells were decreased by Nurr1+Foxa2 overexpression. This study is the first demonstration for the therapeutic potentials of Nurr1 and Foxa2 in PD, and thus can offer promise for the treatment of PD.