헤파린 타우로콜레이트 접합체를 이용한 췌장암 정위모델에서 신생혈관형성 억제 및 항암효과에 관한 연구

Abstract

췌장암은 췌장을 형성하는 조직에서 변형 된 세포에서 발생하는 악성종양이다. 췌장암을 완전히 치료하는 유일한 방법은 바로 조기 암 진단을 통해 수술로서 제거하는 방법뿐이다. 하지만 췌장은 복부 깊은 곳에 위치하고 있으며, 전이하기 전에 뚜렷한 증상이 없다. 그러므로 췌장암 환자의 대부분은 수술적 치료가 불가능하다. 대안으로, 암 환자들은 일반적으로 항암제의 하나인 gemcitabine 같은 약물을 투여 받는다. 이러한 항암제는 cytidine 대신 DNA 에 합성되어 DNA 합성을 방해하는 기작을 통해 세포 독성을 나타낸다. 그렇기 때문에 항암제는 암세포뿐만 아니라 분열하는 일반 세포도 공격을 하여 발진, 탈모, 구토 같은 부작용이 있다. 그러므로 이런 부작용을 극복하기 위해 새로운 접근방법이 필요하다. 일반적으로 대부분의 암 조직은 암 세포로부터 신생혈관 성장인자를 방출함으로써 산소와 영양소를 공급받는 신생혈관형성을 유도한다. 췌장암의 경우도 이런 현상이 일어날 수 있다. 그러므로, 항신생혈관 치료는 췌장암을 치료하는데 유망한 전략이라 생각 된다. 헤파린은 설파이드 그룹이 많이 있는 glycosaminoglycan 으로써, 항응고제로 널리 사용되고 있다. 최근에는, VEGF, bFGF 같은 성장인자와의 결합을 통해 항신생혈관효과가 있다고도 알려지고 있다. 하지만 친수성의 성질 때문에 혈액 내에서 빨리 제거 되기 때문에 치료효과가 충분치 않다. 더욱이 항응고 작용으로 야기되는 내출혈, 헤파린 유발 혈소판 감소증의 부작용을 일으킨다. 이 논문에서, 우리는 헤파린과 소수성의 담즙산인 타우로콜레이트를 화학적으로 결합하여, 헤파린-타우로콜레이트 유도체 나노입자를 만들었다. 하나의 저분자헤파린이 일곱 개의 타우로콜레이트와 결합을 하기 때문에 우리는 LHT7 이라고 이름을 지었다. LHT7 은 스테로이드 링 구조를 가지기 때문에 양친매성 특성을 나타내고, VEGF 와 60 배정도 더 강하게 결합했다. 또한 저분자헤파린을 처리한 그룹에 비해 항응고 효과가 12.7%로 떨어졌는데 그 이유는 바로 타우로콜레이트가 안티트롬빈 3 와 결합하기 때문이다. 이런 이유들 때문에 우리는 LHT7 을 이용하였다. 우리는 처음으로 췌장암 정위모델에서 LHT7 의 항신생혈관 효과를 평가하였다. 혈관내피세포 (HUVEC)와 췌장암세포 (PANC-1)의 세포생존율을 LHT7 를 처리했을 경우 측정한 결과, 혈관내피세포의 생존율은 VEGF165 가 있는 상태에서 LHT7 의 농도가 10 μg/ml 이상일 경우 혈관내피세포에 독성을 나타냈다. LHT7 을 5 μg/mL 처리했을 때의 혈관내피세포의 생존율이 정상 세포를 처리한 그룹의 생존율과 비슷하기 때문에 우리는 LHT7 의 농도를 5 μg/mL 로 최적화하였다. 이런 LHT7 의 항신생혈관 약물효과를 확인하기 위해 혈관내피세포를 가지고 신생혈관형성을 확인하는 실험을 하였다. VEGF165 로 유도된 상처치료이동 실험을 통해서 LHT7 을 5 μg/ml 농도로 처리한 경우, 기존 VEGF165 만을 처리한 그룹에 비해 41.81%정도 혈관내피세포가 이동하는 것을 억제하였다. VEGF165 로 유도된 세포침입 실험을 통해서 LHT7 을 5 μg/ml 농도로 처리한 경우, 기존 VEGF165 만을 처리한 그룹에 비해 55.04%정도 혈관내피세포가 침입하는 것을 억제하였다. 그리고 VEGF165 로 유도된 혈관형성 실험을 통해서 LHT7 을 5 μg/ml 농도로 처리한 경우, 기존 VEGF165 만을 처리한 그룹에 비해 71.15%정도 혈관 길이가 길어지는 것을 억제하였다. 또한 VEGF165 로 유도된 ex vivo 실험인 쥐 동맥 고리 실험을 통해서 LHT7 을 5 μg/ml 로 처리한 경우, 기존 VEGF165 만을 처리한 그룹에 비해 55.25%정도 미세혈관이 형성되는 것을 억제하였다. 또한 정위 췌장암 모델을 만들어서 LHT7 을 5 mg/kg 의 양으로 이틀에 한번씩 정맥주사로 30 일간 투여 후 암의 무게와 부피를 측정한 결과 약물을 처리한 그룹의 암의 무게와 부피가 약물을 처리하지 않은 그룹에 비해 각각 63.43, 64.01%정도 확연하게 줄어듦을 확인할 수 있었다. 암의 성장의 억제를 알아보기 위해, 암 조직을 anti-CD34 와 anti-KI67 을 가지고 면역염색을 한 결과, LHT7 을 (5 mg/kg/2 day) 처리한 그룹의 염색된 anti-CD34 와 anti-KI67 수가 PBS 만을 처리한 그룹에 비해 줄어들었다. 결국 LHT7 이 혈관내피세포의 미세혈관과 세포증식을 억제함으로써 췌장암의 성장을 억제함을 알 수 있었다. 결론적으로 LHT7 이 췌장암을 치료하는 데 효과적인 항신생혈관 약물로 사용될 수 있다고 사료된다.