단일대립유전자 표적화를 통한 배반엽하층 줄기세포의 X 염색체 불활성화 양상 분석

Abstract

최근 Rat의 배반포로부터 분리한 배반엽하층 줄기세포 (Hypoblast stem cell, HypoSC) 는 발달 단계 및 유전자 발현 양상에 있어서 배아줄기세포 (Embryonic stem cell, ESC) 와 매우 가까운 유연관계를 보이는 또 다른 형태의 줄기세포이다. 지금까지 연구된 바에 의하면 ESC 은 Double strand break등과 같은 인위적인 DNA 구조 변화 과정을 도입하지 않고도 상당히 높은 확률로 성공적인 상동재조합이 (Homologous recombination, HR) 이루어지며, 고유의 X 염색체의 불활성화 (X chromosome inactivation, Xi) 양상을 보인다고 알려져 있다. 이에 반해, HypoSC의 경우 이와 같은 기본적인 세포 특성에 대해 아직까지 연구된 바가 없다. 이를 알아보기 위해 X 염색체에 연관되어있는 유전자들 중 하나인 HPRT (Hypoxanthine phosphoribosyl transferase) 의 Knock-out을 통해 HypoSC 에서도 ESC와 마찬가지로 부가적인 DNA 구조 변화 과정을 도입하지 않고도 성공적으로 HR이 수행되는지를 알아보고자 한다. 뿐만 아니라, 한 쌍의 X 염색체를 갖는 자성 (Female) 세포를 이용하여 불활성화 되지 않은 X 염색체 상에서 발현되는 HPRT 유전자의 Knock-out를 통해 후천적 불활성화(Epigenetic inactivation)를 구현하고자 한다. 이후 HAT selection 과정을 통해 Knock-out 된 유전자의 자발적인 회복, 복구 및 보상체계가 존재하는지 여부에 대해 알아보았다. 실험과정 중 HypoSC 에서 특이적으로 나타나는 현상인 세포 수 증가에 따른 자발적인 분화를 피하기 위해 Knock-out 이후 G418 및 6TG를 이용한 Selection 기간을 최소화하기 위한 여러 가지 방법들을 도입하였고, 이를 통해 최종적으로 얻은 Knock-out clone들은 여전히 줄기세포로써의 그 특성을 잃지 않음을 확인하였다. 결론적으로 본 실험결과는 HypoSC의 X 염색체 불활성화 양상에 대한 근본적인 이해와, Cre recombinase를 이용하여 HR가 일어난 자리에 포함되어있는 LoxP site를 중심으로 추후에 더욱 손쉽게 외부 유전자를 도입할 수 있는 Transgene harbor를 제공할 뿐만 아니라, HAT selection을 이용하여 HypoSC의 Trans-differentiation 여부를 추적할 수 있는 강력한 지표로써 사용할 수 있다는 점에서 그 의의를 둘 수 있다.|To address X chromosome inactivation pattern, I isolated hypoblast stem cells (HypoSC), which are related to embryonic stem (ES) cells. ES cells efficiently perform homologous recombination (HR) and lack X chromosome inactivation (Xi), but it is unknown whether the same applies to HypoSC. Using the X-linked hypoxanthine phosphoribosyl transferase (HPRT) gene, I find that HypoSC perform HR with similar frequency as ES cells. Monoallelic targeting in female HypoSC eliminated HPRT gene expression, implying epigenetic inactivation of the other allele. Although density-induced differentiation complicated selection, the targeted clones maintained their original properties. These results will facilitate targeted genetic manipulation of HypoSC and the study of Xi.; To address X chromosome inactivation pattern, I isolated hypoblast stem cells (HypoSC), which are related to embryonic stem (ES) cells. ES cells efficiently perform homologous recombination (HR) and lack X chromosome inactivation (Xi), but it is unknown whether the same applies to HypoSC. Using the X-linked hypoxanthine phosphoribosyl transferase (HPRT) gene, I find that HypoSC perform HR with similar frequency as ES cells. Monoallelic targeting in female HypoSC eliminated HPRT gene expression, implying epigenetic inactivation of the other allele. Although density-induced differentiation complicated selection, the targeted clones maintained their original properties. These results will facilitate targeted genetic manipulation of HypoSC and the study of Xi.