전기화학 측정 방식의 Matrix-metalloproteinase(MMP)-2와 7을 이용한 난소암과 대장암 동시 진단 바이오칩 개발

Abstract

현대에 이르러 과학과 기술의 발달로 삶의 질이 계속해서 향상되고 있고 다양한 분야에서 연구, 개발이 활발히 진행되고 있다. 그 중에서 특히나 인간의 원초적인 욕구인 수명연장에 대한 관심이 크다. 그에 따라 의료기술은 큰 발전을 하였고 연장된 수명으로 인해 고령화 사회를 맞이하게 되었다. 고령화 사회로 인해 건강에 대한 문제와 새로운 산업분야인 실버의료산업의 등장으로 서로가 서로의 발전을 도와주는 상호보완적인 관계가 되어 의료기술은 날이 갈수록 큰 발전을 이룩하고 있다. 또한 정보화 시대를 맞아 네트워크 기술의 혁신적인 발전을 이뤄 언제 어디서나 다양한 분야의 정보를 손쉽게 얻을 수 있게 되면서부터 자가진단의 범위가 넓어지고 있다. 여기에 융합기술의 발달로 학문간의 벽이 무너지면서 다양한 시도가 이어지고 있고 저비용의 언제 어디서든 손쉽게 구할 수 있고 사용할 수 있는 다양한 자가진단기의 대한 연구가 활발하다.[1, 2] 그 중에서 biochip은 저렴한 비용과 짧은 검사시간, 검사장비의 소형화로 인한 휴대성 그리고 소량의 sample로도 검사가 가능하다는 장점이 있어 각광받고 있다[3, 4]. 인간의 다양한 질병 중 생명과 직결된 것으로 사망원인 1위인 암[5]은 아직까지 정확한 발병원인을 찾지 못했고 그 치료방법도 완전하게 알려진 것은 아니다. 다만 발병 초기에 발견하여 조기치료를 한다면 환자의 생존률이 높다[6]. 이에 조기진단의 중요성이 대두되면서 정기적이고 꾸준한 건강검진을 받으라고 사회적으로 권장하고 장려하고 있다. 그러나 사람들은 금전적인, 시간적인 또는 불편과 귀찮음 등 다양한 문제로 인해 조기진단의 중요성을 인식하고 있으면서도 건강 검진을 정기적으로 꾸준히 받지 않는 상황에 직면해 있다[7]. 초기에 특별한 증상이 없고 정밀한 건강검진을 받아야만 진단이 가능한 암들이 있다. 그 중에는 남녀 전체 암 발생률 4위인 대장암과 여성의 3대암중에 하나인 난소암이 있다[8, 9]. 대장암의 확진은 대장 내시경 검사로 조직검사를 하여 암세포를 발견해야 가능하다[10]. 난소암은 초음파 검사와 혈액검사를 병행해야지 정확한 진단이 가능하다.[11, 12] 이 2개의 암은 모두 초기에 증상이 미미하여 상당수의 환자가 암이 상당히 진행된 상태에서 병원을 찾거나 건강검진을 통해 우연히 발견하게 되는 경우가 많다. 암 진단을 위해서는 상당한 시간과 복잡한 과정을 거쳐야 하는 기존의 방법 대신에 신속하고 간단한 조기진단 방법이 다양하게 연구되고 있는 중이다[13, 14]. 그러한 연구 중에 최근에는 바이오마커(biomarker)를 이용한 암 진단 biochip에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다.[15] 난소암 biomarker에는 CA-125, LPA 등이 있으며 대장암 biomarker에는 CEA, SDC-2 등이 있다[16, 17]. MMP’s family는 다양한 암의 단백질 바이오마커로 암의 발생, 진행, 전이 모든 과정에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며 난소암에는 MMP-2가, 대장암에는 MMP-7이 있다.[18] MMP-2는 난소암 종양침윤의 초기단계에 작용하여 기저막을 파괴하는 역할을 하는데 이를 이용해 난소암의 조기진단이 가능하며 MMP-7은 극소량으로도 대장암 진단이 가능하다는 장점이 있다. [19, 20] 바이오마커를 이용한 난소암, 대장암 진단 바이오칩으로는 면역분석법(Immunoassay), 분광분석법(spectrometry), 전기화학측정법(electrochemical measurement) 등을 이용한 것이 있다.[21, 22] 면역분석법은 항원 항체 반응을 이용하여 정확도가 높지만 측정 방법이 복잡하며 오랜 시간이 걸리고, 분광분석법은 생화학 실험에서 정성적인 분석에 널리 사용되고 있고 실험방법이 간단하지만 정량적으로는 분석할 수 없다. 전기화학측정법은 sample의 손상을 최소화하면서 정량적인 측정이 가능하다는 장점이 있다. 본 연구에서는 위에서 언급한 암의 조기진단에 대한 중요성을 인식하고 초기에 증상이 미미하고 진단방법이 번거로운 난소암과 대장암의 기존 진단방법의 문제를 해결하며, 시대에 맞춰 사용자의 편의를 극대화 할 수 있는 방안을 모색하였다. 이전 연구 중에 전기화학측정 방식의 난소암, 대장암 biomarker을 이용한 난소암, 대장암 진단 biochip에 대한 연구가 있지만 MMP-2와 7이 아닌 CA-125, LPA, CEA, SDC-2 등을 사용한 것이다[21]. 또한 이전 연구 중에 MMP-2와 7을 이용한 난소암과 대장암을 진단하는 biochip이 있지만 분광분석법을 사용하여 정량적인 측정이 불가능하였다[22]. 이에 본 연구에서는 다른 biomarker 보다 난소암, 대장암의 조기진단에 적합한 MMP-2와 7을 이용하고, 측정방법으로 전기화학측정 방식을 사용하여 sample에 손상을 최소화하면서 정량적인 측정을 가능하도록 한다. MMP multi biochip은 MMP single biochip 선행연구[23] 내용을 토대로 MMP-2와 MMP-7 enzyme의 concentration을 동시에 측정하면서 기존 single chip의 문제점이었던 유동문제와 좁은 반응면적 그리고 enzyme reaction의 효율을 해결할 수 있도록 설계되었다. MMP-2와 7 enzyme concentration에 따른 impedance를 측정하기 전에 우선 최적실험 조건을 구하기 위해 CV(cyclic voltammetry) 측정을 통해 최적 peptide immobilization time, washing time 그리고 enzyme reaction time을 구하였다. 그 다음 최적실험조건으로 MMP-2와 7 enzyme concentration에 따른 impedance를 측정하여 정량적인 값을 얻을 수 있었다. 또한 여러 biochip(inter-assay)에서의 ‘bare’와 ‘immobilization’ impedance를 비교하여 repeatability가 좋은지 확인하였고 MMP-9과 13을 이용하여 selectivity가 좋은지 확인하였다. 이 결과를 통해 MMP multi biochip의 응용 가능성을 확인하고, 야기 되어지는 문제점들을 해결한다면 현장진단(Point of care testing, ROCT)이 가능한 자가진단기 개발의 기초적인 연구가 될 수 있을 거라 생각한다. |A cancer is general disease in today. Many treatments and tests are developed for cancers. However, the general cancer screening is expensive and has long test time and needs nonportable heavy equipment. Also, people have to go to hospital for checkup personally. So recently there are many research about biomarker. Biomarker is useful in early diagnosis of cancer. It is method which use little sample and has short test time. However, there are problems still. First, test is performed in laboratory. So POCT is impossible. Second, test still use much sample and time. Finally, it can diagnose only one at a time. In order to solve these problems, I make a multi biochip which has two kinds of electrodes(Au working electrode, Pt counter/reference electrode), SU-8 micro channel and PDMS layer with micro mixer. Also I used EIS that is one of electrochemical measurement method. It has advantages that are easy and low damage to sample. MMP-2 and 7 enzyme are used as biomarker for diagnosing ovarian and colorectal cancer. MMP peptide is immobilized on Au electrode and MMP enzyme reacts to it. I take agitation at MMP biochip for increasing efficiency of enzyme reaction. Also I designed chaotic passive mixer for increasing efficiency of agitation. Because of this biochemical reactions, impedance is changed. Impedance is measured by EIS(Electrochemical impedance spectroscopy). I have calibration curve through result of experiment. Therefore MMP-2 and 7 enzyme can be quantitatively detected by measured Impedance at a time. Through repeated experiment, I confirmed repeatability of MMP multi biochip. CV(Coefficient of Variation) is high, so I analyzed data using related impedance. Also, selectivity of biochip was confirmed using MMP-9 and 13. In this study, I confirm possibility about multi biochip of MMP using electrochemical measurement method. This study will be able to be basic research of POCT or self-test of cancer. If some problems which are high CV, selectivity and maintenance of peptide are solved, it will be applied to various biomarker and POCT, self-test device.; A cancer is general disease in today. Many treatments and tests are developed for cancers. However, the general cancer screening is expensive and has long test time and needs nonportable heavy equipment. Also, people have to go to hospital for checkup personally. So recently there are many research about biomarker. Biomarker is useful in early diagnosis of cancer. It is method which use little sample and has short test time. However, there are problems still. First, test is performed in laboratory. So POCT is impossible. Second, test still use much sample and time. Finally, it can diagnose only one at a time. In order to solve these problems, I make a multi biochip which has two kinds of electrodes(Au working electrode, Pt counter/reference electrode), SU-8 micro channel and PDMS layer with micro mixer. Also I used EIS that is one of electrochemical measurement method. It has advantages that are easy and low damage to sample. MMP-2 and 7 enzyme are used as biomarker for diagnosing ovarian and colorectal cancer. MMP peptide is immobilized on Au electrode and MMP enzyme reacts to it. I take agitation at MMP biochip for increasing efficiency of enzyme reaction. Also I designed chaotic passive mixer for increasing efficiency of agitation. Because of this biochemical reactions, impedance is changed. Impedance is measured by EIS(Electrochemical impedance spectroscopy). I have calibration curve through result of experiment. Therefore MMP-2 and 7 enzyme can be quantitatively detected by measured Impedance at a time. Through repeated experiment, I confirmed repeatability of MMP multi biochip. CV(Coefficient of Variation) is high, so I analyzed data using related impedance. Also, selectivity of biochip was confirmed using MMP-9 and 13. In this study, I confirm possibility about multi biochip of MMP using electrochemical measurement method. This study will be able to be basic research of POCT or self-test of cancer. If some problems which are high CV, selectivity and maintenance of peptide are solved, it will be applied to various biomarker and POCT, self-test device.