BMP-2를 도입한 골 유도 재생용 나노섬유막의 개발

Abstract

Electrospun nanofibers have been extensively investigated as an effective membrane for guided bone regeneration. In this study, we developed various bio-functional nanofibers by immobilizing different concentration of bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) as osteoinductive signal on the surface of polydopamine coated electrospun poly(L-lactide) (PLLA) nanofibers. Polydopamine coating improved the surface roughness of nanofiber without any change in overall structure. Surface chemical analysis of nanofibers confirmed polydopamine-mediated BMP-2 immobilization and quantification of BMP-2 using enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) showed very high immobilization efficiency of 80% and over 90% of BMP-2 was retained on the surface of nanofibers at least for five days. Cell adhesion, proliferation and extracellular matrix secretion of human mesenchymal stem cells (hMSCs) cultured on surface modified nanofibers were notably improved which were confirmed by florescent microscopy and scanning electron microscopy (SEM). In vitro osteogenic differentiation studies showed enhanced effects of BMP-2 on ALP activity and calcium mineralization on 14 days of hMSCs culture. Results of in vivo study after 2 months of implantation using radiographic analysis demonstrated that bone regenerated area in 124 ± 9 ng/cm2 of BMP-2 immobilized group was 77.8 ± 11.7% while defect only group and polydopamine coated group showed a limited regeneration of 5.9 ± 1.0% and 34.1 ± 5.5%, respectively. Moreover, implanted fibers showed remarkable bone ingrowth and integration with host tissue which were verified by histological analysis. Particularly, tissue SEM and transmission electron microscopy (TEM) images of BMP-2 immobilized group revealed sufficient interaction between implanted nanofiber and neighboring extracellular environment. Taken together, our data supports the potential use of polydopamine-mediated BMP-2 immobilized nanofibers as an effective membrane for guided bone regeneration.|뼈의 경우 대부분의 경우 잘 알려진 자가 재생과정을 통해 골 재생이 일어나지만 사고나 수술로 인한 임계 크기 이상의 골 손실이 발생할 경우 자가 재생에 한계가 있기 때문에 이를 극복하기 위하여 유도 골 재생 (GBR)을 이용한 치료가 도입되었다. GBR을 위해 사용되는 차폐막은 적절한 공극 크기와 다공성을 갖고 있어서 결함 부위로 원치 않는 조직의 유입은 막고 산소, 영양분, 노폐물의 이동은 자유롭게 하여 재생을 촉진하는 역할을 한다. 본 연구에서는 GBR을 위한 생체활성 차폐막을 개발하기 위하여 생분해성 고분자재료인 PLLA를 전기 방사법을 이용하여 원하는 다공성과 물리적 특성을 갖는 나노 섬유를 제작하였다. 섬유의 표면에 생체활성물질을 도입하기 위하여 폴리도파민 (polydopamine)을 코팅한 후, 폴리도파민의 화학 기작을 이용하여 강력한 골형성 인자인 BMP-2를 화학 시약이나 복잡한 절차 없이 섬유에 표면 고정하여 결함 부위에 안정하고 지속적인 골유도 신호를 전달하도록 하였다. 제작한 나노 섬유의 표면의 구조적, 화학적 특성을 평가하여 폴리도파민 코팅을 이용한 골형성 인자의 표면고정이 섬유의 구조적 변화 없이 높은 효율로 표면에 고정되는 것을 확인하였고, 고정된 인자는 생리학적 조건에서 높은 비율로 표면에 유지되는 것을 관찰하였다. 이후 재료의 골유도능을 평가하기 위한 hMSC를 이용한 세포실험 결과, 섬유에 표면 고정된 BMP-2의 농도가 증가할 수록 재료 위에서 배양한 hMSC의 골분화 정도가 향상된 것을 확인 할 수 있었다. 또한 마우스 두개골 결손모델을 이용하여 제작한 재료의 체내 골형성 유도능을 평가함으로써 BMP-2가 표면고정 된 생체활성 나노 섬유가 골형성을 촉진하고, 재생된 조직이 본래의 골조직과 구조 및 형태가 유사함을 방사선 분석과 조직염색을 통해 확인하였다. 조직 SEM과 TEM을 통해 재생된 조직의 절단면을 관찰하여 이식한 나노 섬유를 따라 재생된 콜라겐 섬유 다발이 배열함을 확인함으로써 재료가 체내에서 조직 재생을 유도하는 역할을 하는 것을 확인하였다. 이러한 연구 결과를 바탕으로, 본 연구를 통해 개발한 BMP-2가 표면 고정된 생체활성 나노 섬유의 향상된 유도 골재생을 위한 차폐막으로써 사용 가능성을 확인 할 수 있었다.; Electrospun nanofibers have been extensively investigated as an effective membrane for guided bone regeneration. In this study, we developed various bio-functional nanofibers by immobilizing different concentration of bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) as osteoinductive signal on the surface of polydopamine coated electrospun poly(L-lactide) (PLLA) nanofibers. Polydopamine coating improved the surface roughness of nanofiber without any change in overall structure. Surface chemical analysis of nanofibers confirmed polydopamine-mediated BMP-2 immobilization and quantification of BMP-2 using enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) showed very high immobilization efficiency of 80% and over 90% of BMP-2 was retained on the surface of nanofibers at least for five days. Cell adhesion, proliferation and extracellular matrix secretion of human mesenchymal stem cells (hMSCs) cultured on surface modified nanofibers were notably improved which were confirmed by florescent microscopy and scanning electron microscopy (SEM). In vitro osteogenic differentiation studies showed enhanced effects of BMP-2 on ALP activity and calcium mineralization on 14 days of hMSCs culture. Results of in vivo study after 2 months of implantation using radiographic analysis demonstrated that bone regenerated area in 124 ± 9 ng/cm2 of BMP-2 immobilized group was 77.8 ± 11.7% while defect only group and polydopamine coated group showed a limited regeneration of 5.9 ± 1.0% and 34.1 ± 5.5%, respectively. Moreover, implanted fibers showed remarkable bone ingrowth and integration with host tissue which were verified by histological analysis. Particularly, tissue SEM and transmission electron microscopy (TEM) images of BMP-2 immobilized group revealed sufficient interaction between implanted nanofiber and neighboring extracellular environment. Taken together, our data supports the potential use of polydopamine-mediated BMP-2 immobilized nanofibers as an effective membrane for guided bone regeneration.