유세포 분석기를 활용한 지방세포의 지방분해 활성 측정법 연구

Abstract

오늘날 비만은 세계적으로 광범위하게 확산되고 있는 질환으로 지방 세포 내 중성지방이 비정상으로 과다하게 축적된 상태를 말한다. 지방 조직은 체내에서 가장 큰 에너지원의 저장소로서, 혈중 잉여의 에너지 원을 중성 지방 (Triglyceride, TG)의 형태로 에너지를 저장하고 있다가 다른 조직에서 에너지원을 필요로 할 때에, 저장형의 중성지방을 글리세롤과 지방산으로 분해하여 에너지로 사용할 수 있도록 제공한다. 지방 세포 내 지방분해의 조절장애는 비만과 제 2형 당뇨, 이상지질혈증 등 각종 대사 증후군을 일으키는 원인이 된다고 밝혀지면서 지방조직에서의 지방 분해에 관한 분자적인 기작의 연구를 비롯하여 지방 분해 촉진 혹은 억제물질의 탐색 등에 관한 다양한 연구가 활발하게 이루어지고 있다. 이러한 연구들에 있어서 지방분해(lipolysis)의 측정은 매우 중요한 생체정보를 제공하게 된다. 지방조직의 지방분해 효소인 hormone sensitive lipase(HSL)의 전형적인 in vitro 활성 측정방법은 중성지방이 분해되어 유리된 글리세롤의 농도를 측정하는 방법이다. 지방세포의 경우 세포의 소수성과 세포 부피의 매우 큰 편차 때문에 다른 조직, 세포 및 혈액의 경우와는 달리 조작상의 균질성과 재현성이 매우 낮은 어려움이 존재하며, 따라서 효소 활성 측정의 정확도와 신뢰도는 매우 크게 떨어진다. 이러한 문제점들을 배제하기 위하여 본 연구에서는 지방 분해에 의해 세포의 부피가 감소하는 현상에 초점을 맞춰 유세포 분석법(Flow cytometry)을 활용한 지방 분해능 측정의 새로운 방법을 조사하였다. 유세포 분석 이란 유액상태의 세포가 일정 광 감지영역 (light sensing area)을 통과할 때 세포가 갖는 부피(크기), 과립도 혹은 세포 내 밀도, 세포 표면에 특정 항원의 존재여부 등의 다양한 특징을 상대적으로 비교 계측하는 기술이다. 본 연구에서는 마우스의 복부 지방 조직에서 분리한 지방세포와 3T3-L1 세포주를 지방세포로 유도 분화시킨 모델 지방세포에 대하여 적용하였다. 먼저 지방세포액의 HSL활성측정을 하기 위해 10-4 M Norepinephrine을 처리한 실험군과 처리하지 않은 대조군을 각각 2 시간 37℃ 에서 배양한 후 4% paraformaldehyde solution으로 세포를 고정시킨 다음 지방 분해에 의해 지방산 및 글리세롤의 방출로 감소된 지방세포의 크기를 FACS를 이용하여 Forward scatter의 영역별 세포 분포 비율로 확인하였다. 그 결과 호르몬으로 유도한 지방분해로 감소한 세포의 크기분포는 두 그룹간 FSC 의 영역에서 확인 할 수 있었으며, 영역에 대한 분포 비율은 기존의 glycerol측정법과 동일한 정도로 환산되었다. 두 번째 실험으로 지방세포의 경우 LDL의 과다 축적에 의해 HSL의 활성이 감소되는 것이 glycerol 측정법으로 보고 되었으므로 동일한 조건의 HSL활성 변화를 FACS에 의해 비교한 결과 cell size 감소 비율 또한 동일한 결과로 얻어졌다. 마지막으로 LDL에 의한 HSL의 지방분해능 감소를 ApoB-100 의 LDLR epitope을 인식하는 항체를 처리하였을 때 지방분해 효소 활성의 회복을 FACS 측정법과 glycerol 측정법에 대해 비교한 결과 동일한 HSL활성 회복을 확인 할 수 있었으나 실험 과정이 복잡해질수록 glycerol 측정법은 오차가 커지며, 재현성이 현저히 떨어졌으나, FACS를 이용한 측정에서는 이러한 문제점을 배제 할 수 있었다. 이 방법은 기존의 glycerol측정법과 비교할 때 실험 오차를 획기적으로 줄이면서 glycerol 측정법 보다 신뢰도가 높은 측정 결과를 얻을 수 있었으므로 본 연구에서는 지방조직에서의 호르몬 의존성 지방분해효소의 지방 분해능을 분석하는 새로운 방법을 제안하였다. |Obesity, a disorder characterized by the accumulation of excessive amounts of triglycerides (TGs) in adipocytes, has become a worldwide epidemic. Adipose tissue, the largest energy reservoir in the body, is responsible for storage of fats in the form of TGs and cholesteryl esters of fatty acids. The fat contents of adipocytes result from a balance of lipid deposition and lipolysis. Dysregulation of lipolysis in adipocytes has been associated with metabolic disorders such as obesity, diabetes mellitus, and dyslipidemia. Therefore, many studies aim to determine the molecular mechanisms of lipolysis in adipocytes and to screen compounds for their lipolytic or antilipolytic effects. Reliable and accurate methods to assess lipolysis are an obvious necessity for such studies to deliver meaningful results. The most common method to assess lipolysis is to measure the release of glycerol from adipocytes in vitro. Although simple in concept, these experiments are complicated by the unique physical properties of adipocytes, most notably their low density, hydrophobicity, and wide cell size variation. These problems lead to a low accuracy and poor reproducibility. The present study therefore aimed to develop a more accurate but simple method for measuring adipocyte lipolysis, and specifically norepinephrine-triggered lipolysis, which depends on hormone-sensitive lipase (HSL). Rather than the release of glycerol, we decided to determine the decrement in adipocyte cell size that is associated with HSL-dependent lipolysis. Flow cytometry is widely used for analyzing cell size distributions in cell populations via light-scattering, fluorescence, and absorbance. Specifically, we decided to test whether HSL-dependent lipolysis can be assessed by measuring the low forward scatter (FSC) parameter. The results clearly demonstrate that compared to the glycerol release-based method, flow cytometry is a more convenient and more accurate method to assess HSL-dependent lipolysis in differentiated 3T3-L1 cells and in primary mouse adipocytes. Moreover, we used our new method to confirm that low density lipoprotein (LDL)-induced suppression of HSL-dependent lipolysis can be blunted with an anti-LDL antibody. In summary, we developed a simple, accurate, and robust new method to assess HSL-dependent lipolysis in vitro, which is superior over the traditional glycerol release assay. We believe that our FACS approach will find broad application in metabolic research.; Obesity, a disorder characterized by the accumulation of excessive amounts of triglycerides (TGs) in adipocytes, has become a worldwide epidemic. Adipose tissue, the largest energy reservoir in the body, is responsible for storage of fats in the form of TGs and cholesteryl esters of fatty acids. The fat contents of adipocytes result from a balance of lipid deposition and lipolysis. Dysregulation of lipolysis in adipocytes has been associated with metabolic disorders such as obesity, diabetes mellitus, and dyslipidemia. Therefore, many studies aim to determine the molecular mechanisms of lipolysis in adipocytes and to screen compounds for their lipolytic or antilipolytic effects. Reliable and accurate methods to assess lipolysis are an obvious necessity for such studies to deliver meaningful results. The most common method to assess lipolysis is to measure the release of glycerol from adipocytes in vitro. Although simple in concept, these experiments are complicated by the unique physical properties of adipocytes, most notably their low density, hydrophobicity, and wide cell size variation. These problems lead to a low accuracy and poor reproducibility. The present study therefore aimed to develop a more accurate but simple method for measuring adipocyte lipolysis, and specifically norepinephrine-triggered lipolysis, which depends on hormone-sensitive lipase (HSL). Rather than the release of glycerol, we decided to determine the decrement in adipocyte cell size that is associated with HSL-dependent lipolysis. Flow cytometry is widely used for analyzing cell size distributions in cell populations via light-scattering, fluorescence, and absorbance. Specifically, we decided to test whether HSL-dependent lipolysis can be assessed by measuring the low forward scatter (FSC) parameter. The results clearly demonstrate that compared to the glycerol release-based method, flow cytometry is a more convenient and more accurate method to assess HSL-dependent lipolysis in differentiated 3T3-L1 cells and in primary mouse adipocytes. Moreover, we used our new method to confirm that low density lipoprotein (LDL)-induced suppression of HSL-dependent lipolysis can be blunted with an anti-LDL antibody. In summary, we developed a simple, accurate, and robust new method to assess HSL-dependent lipolysis in vitro, which is superior over the traditional glycerol release assay. We believe that our FACS approach will find broad application in metabolic research.